耿 麗 王許平 王丹丹 楊貝貝 杜曉博 高 闖 馮百歲

鄭州大學第二附屬醫(yī)院消化內科 鄭州大學第二附屬醫(yī)院炎癥性腸病中心 吳階平醫(yī)學基金會中國炎癥性腸病聯(lián)盟 河南省炎癥性腸病中心(450014)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一組病因不明、反復發(fā)作的腸道慢性炎癥性疾病，主要包括克羅恩病(Crohn’s disease,CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)，其發(fā)病率在全球和我國均呈上升趨勢。目前認為IBD的發(fā)生主要與遺傳易感性、腸道內環(huán)境以及宿主不恰當免疫應答有關[1-2]。氯離子通道(chloride channel,ClC)廣泛分布于多種生物的細胞膜和細胞器膜上，是一類參與氯離子和其他陰離子轉運的通道蛋白。電壓門控ClC-2是ClC家族中的一員，近年來越來越多的證據(jù)表明ClC-2參與IBD的發(fā)生、發(fā)展。在腸道中，ClC-2存在于腸上皮細胞，可調控包括pH值、電興奮性、離子運輸?shù)仍趦鹊亩喾N生理過程和細胞功能，同時在IBD患者中，ClC-2可調節(jié)緊密連接復合體的結構，進而調節(jié)腸黏膜屏障功能，促進損傷的腸道上皮進行修復。本文就ClC-2與IBD關系的研究進展作一綜述。

一、ClC-2的生物學基礎

1.ClC-2的結構和功能：氯離子是生物體內含量最豐富的陰離子，其進出細胞除了依靠繼發(fā)性主動運輸(如Na+-K+-2Cl-同向轉運體等)，還可依靠ClC。Miller[3]首先發(fā)現(xiàn)和克隆了電鰩(Torpedo)電器官中的ClC-0，此是首個被發(fā)現(xiàn)的ClC，隨后依次發(fā)現(xiàn)了包括ClC-2在內的共9個亞型。ClC-2是由CLCN2基因編碼、907個氨基酸構成的相對分子質量為99 kDa(1 Da=0.992 1 u)的蛋白質。目前已知ClC家族共用一個相對保守的蛋白質結構，該結構主要由18個部分跨膜、長度不等且反向平行的α螺旋和兩個胞內的胱硫醚-β-合成酶結合域組成。蛋白質功能和結構分析表明，ClC通道蛋白的同型二聚體即“雙筒槍(double-barreled)”通道結構是其最小的功能單位[4-5]。ClC-2參與多種生理過程和細胞功能，且具有器官和組織特異性，如在神經系統(tǒng)中抑制γ-氨基丁酸(GABA)反應[6]，在視網膜中調節(jié)離子穩(wěn)態(tài)等[7]。此外還有調節(jié)細胞容積、參與鹽的運輸、調節(jié)細胞興奮性等功能。其在消化系統(tǒng)中的作用并未完全闡明，有動物實驗發(fā)現(xiàn)ClC-2可以調節(jié)胃液分泌以及在遠端結腸中介導氯離子吸收[8-9]。但亦有動物實驗表明，與野生小鼠相比ClC-2-/-小鼠胃液和腸液分泌并無明顯差異，但確定的是ClC-2可調節(jié)腸黏膜緊密連接[10-11]。

2.ClC-2的分布和調節(jié)：ClC-2廣泛分布于多種哺乳動物心、腦、腎、消化道等上皮細胞的細胞膜上。在小腸，其主要分布于小腸絨毛上皮細胞頂端。此外基底外側膜、腸上皮細胞胞質區(qū)亦有所分布，而在隱窩中并無分布[12]。研究[13]表明，在小鼠和豬的小腸中，ClC-2主要分布于緊密連接復合體所在的區(qū)域，此種分布方式一方面有利于ClC-2與緊密連接復合體中的分子進行交流，另一方面可能與小腸中ClC-2介導氯離子進出上皮細胞有關。

ClC-2在正電位的情況下處于關閉狀態(tài)，但可在超極化狀態(tài)下被緩慢激活。細胞水腫、細胞外低滲或酸性環(huán)境均可激活ClC-2，此外甲狀腺激素三碘甲狀腺原氨酸(T3)和四碘甲狀腺原氨酸(T4)、神經膠質細胞黏附分子(glial cell adhesion molecule,GlialCAM)、脂肪酸等亦對ClC-2具有調節(jié)作用[4,14-15]。藥物如魯比前列酮(lubiprostone)等可激活腸道上皮細胞中的ClC-2，誘導小腸液分泌，促進受損的腸道黏膜修復[16-17]。

二、ClC-2與IBD的關系

1.ClC-2數(shù)量變化與實驗性結腸炎和IBD的關系：2004年Moeser等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，在缺血損傷的豬回腸黏膜中ClC-2表達增加，推測其可能與腸道損傷修復有關。2009年該團隊又發(fā)現(xiàn)在缺血損傷的小鼠空腸中ClC-2表達增加，而在ClC-2-/-小鼠損傷腸道修復受阻[13]。近年來，諸多研究表明ClC-2數(shù)量或分布的變化與實驗性結腸炎和IBD密切相關[18]。Nighot等[19]采用免疫組化法測定小鼠結腸中ClC-2分布。與健康對照組相比，葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導結腸炎的小鼠ClC-2總表達無明顯變化，但其在小鼠腸道表層上皮的核上胞質區(qū)呈現(xiàn)出明顯聚集狀態(tài)，而在上皮細胞頂側膜的分布卻顯著減少。同時發(fā)現(xiàn)在ClC-2-/-小鼠中，腸道通透性和結腸炎的嚴重程度均較健康對照組明顯增加。此外發(fā)現(xiàn)在UC患者體內，ClC-2表達顯著降低。Jin等[20]亦發(fā)現(xiàn)預防性應用ClC-2激活劑魯比前列酮可降低DSS誘導小鼠結腸炎的嚴重程度，已誘導產生結腸炎的小鼠應用魯比前列酮后可使腸道受損黏膜恢復加快。

2.ClC-2與腸黏膜屏障：腸黏膜屏障中含有各種高度有序的細胞間連接，主要包括黏著連接(adherens junction)、橋粒(desmosome)、縫隙連接(gap junction)、緊密連接(tight junction)等[21]，其中緊密連接是調節(jié)腸上皮屏障功能的重要組分。細胞間緊密連接主要由多種緊密連接蛋白組成，包括閉鎖小帶蛋白(ZO-1)、封閉蛋白(occludin)、閉合蛋白(claudins)、鈣黏蛋白(cadherin)等，正常情況下緊密連接是腸道細胞抵御有害物質侵襲的第一道防線[22]。研究指出，緊密連接破壞導致的腸道通透性增加是腸道炎癥發(fā)生、發(fā)展的重要因素[23-24]。ClC-2主要位于小腸絨毛頂端的緊密連接區(qū)域，在穩(wěn)態(tài)和病理狀態(tài)下其對腸黏膜屏障的作用有所不同，在IBD動物模型中，其可通過調節(jié)緊密連接的結構和組分進而促進腸道屏障功能的恢復。

①ClC-2與正常腸黏膜：ClC-2對正常腸黏膜的作用目前尚存爭議。有研究[25]表明在小鼠正常腸道上皮中ClC-2會導致屏障功能減弱，主要表現(xiàn)為ClC-2-/-小鼠腸道跨上皮電阻(transepithelial electrical resistance,TER)較正常對照組明顯增加，被標記甘露醇的清除率明顯降低，提示腸黏膜通透性降低。同時發(fā)現(xiàn)ClC-2-/-小鼠肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)介導的肌球蛋白輕鏈(myosin light chain， MLC)磷酸化明顯減少。有文獻報道MLCK的誘導激活可破壞細胞間緊密連接，增加腸黏膜通透性，進而減弱屏障功能，該發(fā)現(xiàn)與上述研究結果一致[26]。ClC-2-/-小鼠與正常小鼠相比，腸絨毛超微結構發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為絨毛頂端變細，橫向紋路增多，且緊密連接界限不清。ClC-2導致正常腸道上皮屏障功能減弱的具體機制目前尚未明確，推測其可能作為一種離子通道，在腸黏膜上造孔供離子進出，從而破壞了黏膜的完整性[27]。然而，另有研究[28]表明，在早期的單層Caco-2細胞中，用小干擾RNA沉默ClC-2基因會導致TER形成延遲以及影響occludin蛋白定位。同時在ClC-2過表達的Caco-2細胞中，菊粉和10 kDa葡聚糖流量明顯降低，同時TER較對照組明顯增加，表明在Caco-2細胞中ClC-2對上皮屏障功能發(fā)揮有益效應[29]。

②ClC-2與受損腸黏膜：腸黏膜屏障是腸道重要的結構和功能屏障，對于水分、離子以及營養(yǎng)物質的吸收至關重要，同時亦可抵御毒素和病原體入侵[30]。機械屏障是腸黏膜屏障的重要組成部分，其結構基礎為完整的腸上皮細胞和細胞間的緊密連接。緊密連接結構的破壞會導致腸壁通透性增加，進而引起炎癥反應[31]。腸黏膜完整性的破壞和緊密連接的改變在IBD的發(fā)生、發(fā)展過程中至關重要。

Moeser等[17]研究豬回腸缺血性損傷時發(fā)現(xiàn)前列腺素E2可誘導短路電流產生以及TER顯著增加，提示腸黏膜通透性降低，屏障功能恢復。進一步研究表明該短路電流的產生主要與氯離子分泌有關，ClC-2與occludin蛋白在上皮細胞中的共表達對腸黏膜屏障功能的修復起著至關重要的作用。另有研究表明，在DSS誘導的ClC-2基因沉默的Caco-2細胞中，TER的下降程度顯著高于陰性對照組細胞[27]。在DSS誘導的小鼠結腸炎模型中，緊密連接蛋白的數(shù)量和分布均與野生型明顯不同，在ClC-2-/-小鼠中此種差異更為顯著。Claudin-2作為一種成孔蛋白，能誘導腸黏膜對小分子物質通透性增加，其在IBD動物模型和UC患者中表達增高[19]，預防或治療性應用ClC-2激活劑后，DSS誘導的野生型小鼠claudin-2表達顯著降低[20]。此外，ClC-2可介導occludin蛋白在胞膜和胞質內轉運。在DSS誘導的小鼠結腸炎模型中，occludin蛋白在胞膜的含量減少，在胞質中含量增多，ClC-2-/-小鼠由小窩蛋白-1(caveolin-1)和質膜微囊參與的occludin蛋白從胞質至胞膜的轉運受限，因此緊密連接恢復受阻[19,20,27]，目前為止，ClC-2調節(jié)occludin蛋白運輸?shù)木唧w機制尚未完全闡明，可能與其自身構象改變以及胞膜上某些受體有關，但可明確的是其對多種緊密連接蛋白的調節(jié)有利于緊密連接復合體重新裝配，促進了DSS誘導結腸炎小鼠腸道屏障功能的恢復。

上述研究結果表明，ClC-2在腸黏膜中可能發(fā)揮著雙重作用，一方面在正常腸道中，ClC-2缺失會引起腸黏膜通透性降低以及腸黏膜屏障功能提高，另一方面在IBD等疾病導致的受損腸黏膜中，ClC-2缺失會導致疾病嚴重度增加，腸道通透性增加，緊密連接復合體裝配受阻，應用ClC-2激活劑則可促進腸黏膜屏障功能修復，提示ClC-2在受損腸黏膜中發(fā)揮保護作用，該作用可能是通過調節(jié)緊密連接蛋白在胞膜和胞質中的循環(huán)實現(xiàn)的。

三、ClC-2與細胞因子

在DSS誘導的結腸炎中，ClC-2-/-小鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β及其mRNA水平較野生型小鼠成倍增加，干擾素(IFN)-γ亦有所增加，此類促炎因子可誘導MLCK激活，破壞細胞間緊密連接，降低屏障功能，誘導或加重炎癥反應[17,19]。同時有體外實驗證實了細胞間緊密連接通透性的增加與上述occludin蛋白的轉運無關[32]。Monteleone等[33]指出，在CD中TNF-α、IFN-γ等可激活輔助性T細胞17(Th17)等相關細胞，引起腸道炎癥反應，進而導致IBD發(fā)生。這些細胞因子的改變與ClC-2-/-小鼠結腸炎的嚴重程度一致。此外，Jin等[20]亦發(fā)現(xiàn)，預防或治療性應用ClC-2激活劑后，在DSS誘導的野生型小鼠結腸炎中，結腸TNF-α和IL-1β含量明顯降低，IL-10含量增加。在遠端結腸中，轉化生長因子(TGF)-β表達明顯增加，可能與ClC-2激活劑抑制腸道炎癥反應，干擾抗炎細胞因子的信號轉導有關。

四、結語

ClC-2是IBD發(fā)病機制中起重要作用的一種離子通道，可影響多種細胞因子的表達，緩解腸道炎癥，同時在腸黏膜修復過程中，可通過改變緊密連接蛋白的含量和分布，調節(jié)緊密連接復合體的裝配，從而促進受損腸黏膜的修復。對ClC-2的深入研究有助于更好地闡明IBD的發(fā)病機制，同時可應用針對ClC-2的靶向激活藥物，為IBD的治療提供新思路。