田耕晨，曾文濤

(1.紹興市高級中學，浙江 紹興 312000； 2.紹興文理學院，浙江 紹興 312000)

脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌細胞外膜的組分，作為一種免疫激活劑，常用于免疫學研究和臨床醫(yī)學中，其在新興的無脊椎動物免疫學研究方面應用較少。已有研究表明，脂多糖對櫛孔扇貝血清和血細胞中酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)的活力有激活加強作用[1]，并可顯著增強櫛孔扇貝血細胞的吞噬活力[2]。但上述研究僅限于部分海產(chǎn)貝類，有關(guān)三角帆蚌ACP、AKP的相關(guān)報道較為少見[3-4]，尤其是LPS對其活力的影響罕見報道。三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)是我國特有的淡水育珠蚌，但不當?shù)闹仓槭中g(shù)、不良的水體環(huán)境和對河蚌進行高密度吊養(yǎng)及不當?shù)氖┓蕦е滤w富營養(yǎng)化都會導致三角帆蚌抵抗力下降、感染細菌等疾病[5-6]。本研究以三角帆蚌為試驗材料，注射LPS后，于不同時間測定其血清中ACP、AKP的活力，以探討LPS對三角帆蚌血清中2種水解酶活力影響及其規(guī)律，從而為探討LPS作為免疫激活劑應用于淡水育珠蚌的免疫學研究和疾病預防提供一定的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 三角帆蚌與LPS誘導刺激

三角帆蚌購自諸暨某珍珠養(yǎng)殖場，平均體重約100 g，在經(jīng)曝氣的水族箱(5 m×3 m×2 m)中暫養(yǎng)7 d(22±2)℃。每只蚌于閉殼肌中注射50 μg LPS進行誘導刺激(Sigma公司產(chǎn)品，濃度1 μg·μL-1)，試驗組注射等量生理鹽水，設(shè)3個平行。

1.2 血清的準備

誘導刺激后6、12、24、48、72和96 h，分別用注射器從閉殼肌中抽取血淋巴，于4 ℃ 3 000g下離心10 min，取上清用于ACP、ALP酶活力的測定。

1.3 酶活力的測定

根據(jù)南京建成生物工程研究所的ACP、AKP酶活測定試劑盒說明書，進行三角帆蚌血清上ACP和AKP活力的測定。用Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計，t檢驗顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS誘導刺激對三角帆蚌ACP活力的影響

在LPS誘導刺激后，分別于6、12、24、48、72和96 h測定三角帆蚌血清中ACP的活力，具體結(jié)果如圖1所示。自LPS誘導刺激6 h起ACP活性快速增強(為對照組的2倍以上)，至48 h達到峰值(近2.8倍)，隨后又逐漸下降；96 h時，ACP活力基本與6 h時相近。同時在試驗期間所有時間段內(nèi)(6～96 h)，試驗組的ACP活力均顯著高于對照組(P<0.05)，其中48 h時極顯著高于對照組(P<0.01)。表明LPS誘導刺激對ACP活力具激活增強作用。

圖1 LPS誘導刺激對ACP活力的影響

2.2 LPS誘導刺激對三角帆蚌AKP活力的影響

在LPS誘導刺激后，分別于6、12、24、48、72和96 h測定三角帆蚌血清中AKP活力，具體結(jié)果如圖2所示。自LPS誘導刺激6 h起AKP活性逐漸增強，至48 h達到峰值(為對照組的2.65倍以上)，隨后又逐漸下降；96 h時，AKP活性略高于對照組；12～72 h時，試驗組的AKP活力均顯著高于對照組，其中48 h時極顯著高于對照組(P<0.01)。表明與ACP相似，LPS誘導刺激對AKP活力也具有較強激活增強作用。

圖2 LPS誘導刺激對AKP活力的影響

3 討論

有關(guān)軟體動物免疫機制的研究受到國內(nèi)外關(guān)注[7-10]。已有研究表明，在缺乏特異性免疫球蛋白的軟體動物體內(nèi)，水解酶在清除異物的過程中發(fā)揮了重要作用[10-12]，參與病原微生物、寄生蟲和腫瘤的殺滅和清除等過程。

ACP是溶酶體的標志酶。在酸性環(huán)境下，酸性磷酸酶能夠通過水解作用將表面帶有磷酸酯的異物破壞掉，從而達到預防感染的目的，并可修飾或改變外來異物的表面分子組成，從而增強血細胞對異物的識別，起到調(diào)理的作用，加快吞噬細胞對異物的吞噬和降解速度[13]。同ACP一樣，AKP也是軟體動物溶酶體酶的重要組分，在免疫反應、調(diào)節(jié)體內(nèi)的鈣磷代謝和角蛋白分泌，以及軟體動物貝殼的形成等生物學過程中發(fā)揮重要作用[14-15]。

本研究結(jié)果顯示，在LPS誘導刺激6 h后，三角帆蚌血清中ACP和AKP的活力均逐漸增強，并均與48 h達到峰值，隨后下降，呈明顯先升后降的趨勢，表明與其他貝類中的研究結(jié)果類似，LPS誘導刺激，對三角帆蚌血清中的ACP、AKP活力有激活加強作用，也證明這兩種水解酶對貝類天然免疫反應過程具有重要作用。但LPS刺激后，三角帆蚌血清中2種酶活力的變化稍有差異，ACP活力在試驗期間所有時間段內(nèi)(6～96 h)，試驗組均顯著高于對照組；而AKP活力在12～72 h時，試驗組的AKP活力均顯著高于對照組?？傊狙芯棵鞔_了LPS誘導刺激對三角帆蚌血清中ACP和AKP 2種水解酶活力的刺激增強作用。

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