王曉樂，楊艷萍，付雙彬，姚麗娟，曾愛平，應(yīng) 震，周 莊

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325005)

寒蘭(CymbidiumkanranMakino)，蘭屬地生植物，株型修長健美，葉姿優(yōu)雅俊秀，花色艷麗多變，香味清醇久遠(yuǎn)，為國蘭之一，在我國具有悠久的栽培歷史。寒蘭大多于10月至翌年2月開花，花期較長，且早于大多數(shù)春天開花的蘭科植物，導(dǎo)致不同種質(zhì)資源(包括同屬和不同屬蘭科植物)因花期不遇、地理隔離無法進(jìn)行雜交，嚴(yán)重制約寒蘭育種研究的發(fā)展。

花粉生活力測定與儲藏性的研究是解決雜交親本在空間與時(shí)間上的隔離進(jìn)而擴(kuò)大育種范圍的前提，但目前未見針對寒蘭花粉生活力檢測及貯藏性的相關(guān)研究報(bào)道。早期花粉生活力的研究主要集中在萌發(fā)培養(yǎng)基的成分篩選上，尤其是蔗糖濃度的選擇。Pritchard等[1]在1910年以2種歐洲蘭花為材料，篩選出最適宜萌發(fā)的培養(yǎng)基蔗糖濃度為5%～10%；除此之外，以其他11種蘭花花粉為材料，對其花粉萌發(fā)影響因素和貯藏特性進(jìn)行了研究。邵青松等[2]研究金線蓮花粉的萌發(fā)結(jié)果顯示，花粉活力表現(xiàn)出先升后降的趨勢，開花第3天的花粉活力最強(qiáng)，適當(dāng)?shù)牡蜏乜梢匝娱L花粉生活力。鄧茜玫等[3]對聚石斛花粉生活力進(jìn)行研究，篩選出了最適宜的花粉萌發(fā)培養(yǎng)基，開花8 d之前的花粉生活力均高于65%，作為父本授粉結(jié)實(shí)率高于85%；-20 ℃貯存90 d后花粉萌發(fā)率降為21.7%，雜交授粉后仍然能夠正常結(jié)實(shí)。

本研究采用固體培養(yǎng)基，研究了蔗糖、氯化鈣、硼酸對寒蘭花粉萌發(fā)的影響，對比了不同干燥時(shí)間、貯藏溫度、貯藏時(shí)間對花粉生活力的影響，以期篩選出寒蘭花粉離體萌發(fā)最佳培養(yǎng)基和適宜的花粉貯藏方法，為有效開展寒蘭雜交育種提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)于2016年11月至2017年4月進(jìn)行，材料為浙江省亞熱帶作物研究所大棚生長的浙江寒蘭(簡稱寒蘭)。

1.2 處理設(shè)計(jì)

1.2.1 花粉萌發(fā)培養(yǎng)基篩選

采用3因素4水平正交試驗(yàn)：蔗糖濃度設(shè)1%、5%、10%、15% 4個(gè)濃度梯度，單位為g·100 mL-1；氯化鈣設(shè)10、50、100、150 mg·L-14個(gè)濃度梯度；硼酸設(shè)10、50、100、150 mg·L-14個(gè)濃度梯度。所有母液用針頭濾器(Millipore，0.22 μm)滅菌，所有用水為無菌水。配置好所有正交試驗(yàn)組合之后，加瓊脂至濃度為0.3%(單位為g·100 mL-1)，完全溶解后加2.5 mL固體培養(yǎng)基到40 mm一次性培養(yǎng)皿中鋪板。取開花后3～5 d的花粉塊于適量無菌水中吸脹30 min，用移液槍打散花粉團(tuán)，每個(gè)培養(yǎng)皿點(diǎn)6個(gè)花粉斑，每個(gè)斑點(diǎn)3 μL。培養(yǎng)皿置于25 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)36 h，于生物顯微鏡(Olympus，BX53)下鏡檢，每個(gè)試驗(yàn)組觀測最少5個(gè)視野，每個(gè)視野最少觀察50個(gè)花粉粒，并統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。花粉萌發(fā)以花粉管長度大于花粉粒2倍直徑為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 干燥時(shí)間對花粉萌發(fā)的影響

收集開花后3～5 d的花粉分裝入3個(gè)10 mL圓底管中，置于干燥器中室溫干燥1、2、3 d，以不干燥花粉作為對照。將4組花粉于-20 ℃貯存15 d，后轉(zhuǎn)移至4 ℃放置2 h，30～35 ℃水浴鍋復(fù)水30 min，進(jìn)行花粉萌發(fā)試驗(yàn)。顯微鏡觀察并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.2.3 低溫貯存對花粉萌發(fā)的影響

收集開花后3～5 d的花粉，干燥1 d，分別置于4、-20、-80 ℃進(jìn)行保存，于15、30、90 d檢測不同貯存溫度下花粉萌發(fā)率。-20、-80 ℃取出的花粉需梯度恢復(fù)至室溫再進(jìn)行復(fù)水。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對寒蘭花粉萌發(fā)的影響

氯化鈣濃度對花粉萌發(fā)具有較大的影響(表1)。當(dāng)氯化鈣濃度為10、50 mg·L-1時(shí)，平均萌發(fā)率分別為79%和78%，濃度為100、150 mg·L-1時(shí)，平均萌發(fā)率則分別下降到69%和64%。蔗糖對寒蘭花粉萌發(fā)影響僅次于氯化鈣，最適宜濃度為1%，但與5%、10%濃度下的平均萌發(fā)率差異并不顯著；當(dāng)蔗糖濃度為15%時(shí)，其平均萌發(fā)率顯著降低。硼酸對寒蘭花粉萌發(fā)的貢獻(xiàn)率相對最小，最適濃度為50 mg·L-1。由此正交試驗(yàn)得出的寒蘭花粉萌發(fā)最優(yōu)培養(yǎng)基組合為蔗糖1%，硼酸50 mg·L-1，氯化鈣10 mg·L-1。

2.2 干燥時(shí)間對寒蘭花粉萌發(fā)的影響

花粉含水量是影響花粉低溫保存質(zhì)量的重要因素，含水量越高，冷凍時(shí)越容易形成冰晶，細(xì)胞膜受損越嚴(yán)重，花粉死亡率就越高。結(jié)果顯示：未經(jīng)干燥處理的花粉萌發(fā)率為69%；干燥1 d的花粉在-20 ℃保存15 d，其萌發(fā)率最高可達(dá)79%；干燥2、3 d的花粉萌發(fā)率大幅降低，分別為38%和29%。

2.3 低溫貯存對花粉萌發(fā)的影響

花粉的低溫保存(4～-20 ℃)是一種操作簡便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的花粉保存方法[4]，能延長花粉的

表1 不同培養(yǎng)基中寒蘭花粉的萌發(fā)率

壽命，解決植物雜交育種中花期不遇及異地雜交的難題。本研究結(jié)果(表2)表明，3種不同溫度下低溫保存30 d，花粉萌發(fā)率均可達(dá)50%以上；其中，-80 ℃保存30 d的花粉萌發(fā)率最高，為66%，基本滿足授粉結(jié)實(shí)的要求。低溫保存90 d，-80 ℃保存的花粉萌發(fā)率急劇下降到40%，-20 ℃保存的花粉萌發(fā)率相對最高，為48%，4 ℃保存的花粉萌發(fā)率最低，僅為31%。

表2 低溫貯存對寒蘭花粉萌發(fā)率的影響

注: 同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

3 討論

花粉是種子植物雄配子體或雄配子細(xì)胞的載體，其生活力決定了受精過程的成敗，花粉萌發(fā)率則是衡量其生活力的重要指標(biāo)。本研究通過正交試驗(yàn)篩選出寒蘭花粉萌發(fā)的最優(yōu)培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步研究了干燥、低溫對花粉貯藏性的影響。

蔗糖是大多數(shù)植物花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基必不可少的成分，不僅可以平衡培養(yǎng)基與花粉內(nèi)外滲透壓，還可為花粉管的生長提供碳源[5]，其最優(yōu)濃度隨物種的變化差異較大。除本研究中所用寒蘭之外，香莢蘭所需最佳蔗糖濃度也為5%[6]，聚石斛[3]、墨蘭[7]、卡特蘭[8]和白芨[9]的花粉萌發(fā)所需最佳蔗糖濃度均為10%；個(gè)別蘭科植物花粉萌發(fā)需高濃度蔗糖，如無距蝦脊蘭[10]和大花蕙蘭[11]，分別為20%和30%。除了濃度差別，碳源種類也會影響花粉萌發(fā)。楊文波等[6]研究表明，離體培養(yǎng)莢蘭花粉萌發(fā)時(shí)，以5%的乳糖為碳源萌發(fā)率最高，其次是5%蔗糖，果糖效果最差。

花粉的離體萌發(fā)和花粉管生長都需要從培養(yǎng)基中吸收大量鈣離子，降低培養(yǎng)基中的鈣離子濃度能夠明顯抑制花粉萌發(fā)，因此，適宜的鈣離子濃度是花粉體外萌發(fā)所必需的[12]。外源鈣可以替代花粉萌發(fā)時(shí)的群體效應(yīng)[13]。本試驗(yàn)中，鈣離子濃度對寒蘭花粉離體萌發(fā)影響顯著，最適宜濃度為10 mg·L-1，高濃度鈣離子會抑制花粉管萌發(fā)，與之相似的是墨蘭，最適鈣離子濃度僅為5 mg·L-1[7]。但在卡特蘭離體萌發(fā)培養(yǎng)基中，鈣離子可高達(dá)150 mg·L-1，但是只起輔助作用[8]，這可能是由于寒蘭和卡特蘭親緣關(guān)系較遠(yuǎn)而造成的。

花粉貯存是解決花期不遇、地理隔離型生殖隔離的有效手段。本研究中，4 ℃貯存的寒蘭花粉在所檢測的時(shí)間點(diǎn)萌發(fā)率均最低；保存30 d，-80 ℃貯存的花粉萌發(fā)率最高；保存90 d，-20 ℃貯存的花粉萌發(fā)率最高。因此，若需長期保存花粉，推薦采用-20 ℃。部分超低溫保存的植物花粉萌發(fā)率可以基本不變，甚至個(gè)別物種在保存過程中萌發(fā)率還出現(xiàn)上升的情況[14-15]。但本研究中，-80 ℃保存的寒蘭花粉萌發(fā)率下降十分嚴(yán)重，原因可能是-80 ℃對缺乏凍存保護(hù)劑的花粉造成了損傷，降低了其萌發(fā)率[16]，未進(jìn)行預(yù)冷凍和程序性降溫也可能是導(dǎo)致花粉萌發(fā)率下降的原因之一。

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