岳占龍，崔元璐

（天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津 300193）

骨關節(jié)炎（OA）是一種以關節(jié)軟骨退行性病變和繼發(fā)性骨質增生為特征的慢性關節(jié)疾病。65歲以上的老年人，其骨關節(jié)炎的患病率高達33.9%[1]。骨關節(jié)炎自我修復能力差，傳統(tǒng)治療僅能夠在一定程度上緩解癥狀、延緩病情發(fā)展，缺少有效的治療措施。關節(jié)腔內直接給藥和干細胞注入修復，是骨關節(jié)炎治療的新策略。海藻酸鈉（SA）是生物相容性良好的天然多糖，能與Ca2+絡合形成經典的蛋盒結構凝膠[2-4]。實驗發(fā)現(xiàn)葛根素（Pu）可參與海藻酸鈣凝膠構建，增加海藻酸鈣凝膠的強度，同時Pu具有誘導間充質干細胞向軟骨細胞分化的活性[5]。研究發(fā)現(xiàn)骨關節(jié)炎患者關節(jié)液中鈣離子濃度較高[6-7]，利用這一特點，構建SA、Pu參與的可注射型離子敏感凝膠，對骨關節(jié)炎患者關節(jié)液中較高濃度的Ca2+產生響應，在關節(jié)腔中由液體狀態(tài)迅速形成凝膠，作為藥物控釋或者負載干細胞的載體，通過干細胞的多向分化潛能，修復重建軟骨組織來治療骨關節(jié)炎。

1 試劑與儀器

海藻酸鈉，生工生物工程(上海)股份有限公司，中國；葛根素（純度＞99%），上海永恒生物科技有限公司，中國；粉防己堿（Tet，純度＞98%），上海永恒生物科技有限公司，中國；無水氯化鈣（CaCl2純度≥96%），天津市風船化學試劑科技有限公司，中國；色譜純甲醇，天津康科德有限公司，中國；色譜純乙腈，天津康科德有限公司，中國；苯甲酸，天津市光復精細化工研究所，中國；粉防己堿標準品，中國食品藥品檢定研究院；葛根素標準品，中國食品藥品檢定研究院。

DV-III程序式黏度計，Brookfield公司，美國；智能溫控式恒溫金屬浴，杭州博日公司，中國；AR1000流變儀，TA公司，美國；Quanta 200環(huán)境掃描電子顯微鏡，F(xiàn)EI公司，美國；SPH-111B大容量恒溫培養(yǎng)搖床，上海世平實驗設備有限公司，中國；2695型高效液相色譜儀，Waters公司，美國；Kromasil 100-5 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm），Eka Chemicals AB 公司，瑞典。

2 實驗方法

2.1葛根素-海藻酸鈣凝膠的制備 稱取一定量的SA，加入適量超純水,45℃電磁攪拌4～6 h至完全溶解，4℃條件下放置24 h，成穩(wěn)定的溶膠，備用。在SA溶液中加入一定質量的Pu粉末，50℃條件下溶解或者分散均勻，得到兩者的混合液。純水配制CaCl2溶液，在西林瓶中快速拌條件下將等體積的SA與CaCl2溶液混合均勻，常溫放置2 h使凝膠充分溶脹，得到一系列處方凝膠。采用翻轉小瓶法初步判斷處方中SA、CaCl2與Pu三者濃度對凝膠強度影響的大小與三者所需的濃度范圍，以凝膠強度可以承受自重翻轉為佳。

2.2葛根素-海藻酸鈣凝膠黏度測定 按照3.1中方法制備以下處方：（1）0.5%SA、（2）1.0%SA、（3）1.5%SA、（4）1.0%SA+0.2%Pu、（5）1.0%SA+0.5%Pu、（6）1.0%SA+1.0%Pu、（7）0.5%SA+6 mmol/L CaCl2、（8）0.5%SA+6 mmol/L CaCl2+0.15%Pu、（9）0.5%SA+6 mmol/L CaCl2+0.25%Pu、（10）0.5%SA+6 mmol/L CaCl2+0.5%Pu，溫度為37℃條件下，采用DV-III黏度計64號探頭，液面下深度2.5 cm對進行粘性測定。

2.3凝膠最佳處方篩選 按照3.1中制備方法，依據(jù)凝膠制備所需三者的濃度范圍，采用單一變量法調整SA、CaCl2和Pu的濃度制備凝膠，CaCl2設置4、6、8 mmol/L 3個濃度梯度，SA 設置 0.55%、0.60%、0.65%、0.70%4個濃度梯度，Pu設置0.03%、0.1%、0.2%3個濃度梯度。通過流變儀測定凝膠流變流參數(shù)，從流變學結果中篩選最佳處方，流變儀參數(shù)：振動過程，角頻率 0.1～100 rad/s，20 mm 錐形盤，溫度37℃。

2.4掃描電鏡分析 按照3.1中制備方法，按照以下處方制備凝膠：1）1.0%SA+0.2%Pu；2）0.5%SA+4 mmol/L CaCl2+0.2%Pu；3）0.5%SA+4 mmol/L CaCl2；4）0.5%SA+8 mmol/L CaCl2，溶脹均勻后，在-80℃冰箱中預凍，然后在凍干機中凍干，用手術刀片將凍干樣品切片，噴金后掃描電鏡下觀察凝膠的微觀結構。

2.5凝膠溶脹、降解實驗

2.5.1凝膠的溶脹實驗 按照3.1中制備方法，制備兩種處方凝膠：0.6%SA+6 mmol/L CaCl2、0.6%SA+6 mmol/L CaCl2+0.2%Pu，每組平行4個樣本，在15 mL離心管中稱量質量約2 g，于真空干燥箱中65℃真空干燥超過24 h，得到干燥凝膠，稱量干燥凝膠的質量，加含有0.01%苯甲酸的無菌PBS溶液至15 mL，保存于37℃環(huán)境，于設定時間點棄去PBS溶液，濾紙吸取凝膠表面水分，稱量凝膠濕質量，根據(jù)溶脹率計算公式得到溶脹率：

Wo為凝膠干重，Wt為凝膠溶脹后質量。

2.5.2凝膠的體外降解實驗 按照3.5.1方法制備凝膠，每組平行4個，在15 mL離心管中稱量質量約2 g，于真空干燥箱中65℃真空干燥24 h以上，得到干燥凝膠，稱量干燥凝膠的質量，加PBS溶液后，置于37℃恒溫搖床中，于固定時間點取樣，濾紙吸取凝膠表面水分，真空干燥并稱質量，得到降解后凝膠的干質量，通過對比凝膠降解后損失質量與降解前干重得到降解率。

2.6葛根素海藻酸鈣凝膠的體外藥物釋放 配制1.2%SA溶液和12 mmol/L CaCl2溶液，按照3.1中方法，用1.2%SA溶液溶解Pu，12 mmol/L CaCl2溶液溶解粉防己堿(Tet)。使用以上溶液制備兩種凝膠，處方為：0.6%SA+6 mmol/L CaCl2+0.2%Pu+0.05%Tet、0.6%SA+6 mmol/L CaCl2+0.05%Tet。釋放過程在恒溫搖床中完成[8],釋放介質為含有0.01%苯甲酸PBS溶液，通過0.22 μm孔徑濾膜除菌，稱量質量為2 g凝膠密封于截留量為7 000 Da的半透膜中，釋放條件為：PBS溶液100 mL，溫度為37℃，轉速為55 r/min，采樣時間點為：0.5、1、3、7、12、24、48、72 h，取樣2 mL，同時補充PBS溶液。采用HPLC方法探索流動相比例，對Pu、Tet標準品溶液進樣，檢測波長分別為250 nm、278 nm，繪制積分面積-濃度標準曲線，同樣方法測定樣品中Pu、Tet濃度，計算藥物的累積釋放速率。

3 實驗結果

3.1葛根素-海藻酸鈣凝膠的制備 當CaCl2濃度達到3.0 mmol/L時即發(fā)生弱的膠凝現(xiàn)象，隨著鈣離子濃度增加膠凝強度增加，凝膠強度越弱則流動性越明顯，凝膠強度過大則會出現(xiàn)局部膠凝，凝膠體積縮小并有水析出，通過翻轉小瓶法初步判斷處方中SA、CaCl2和Pu對凝膠強度影響由大到小依次為CaCl2＞SA＞Pu，膠凝化良好時3種材料的濃度范圍依次為 CaCl2：5～7 mmol/L、SA：0.5%～1.0%、Pu 濃度＜0.3%。

3.2葛根素-海藻酸鈣凝膠黏度測定結果 由表1數(shù)據(jù)可知，對于SA溶液，隨著SA濃度增加，黏度不斷增加，每增加0.5%濃度，黏度增加3～8倍，形成凝膠后黏度快速增加，Pu微溶于水并具有水化特性，當Pu過飽和時，能夠使SA溶液和凝膠黏度明顯增加，未飽和時（≤0.25%）對SA溶液和凝膠黏度無明顯影響，處方中3種原料對凝膠黏度影響大小順序為 CaCl2＞SA＞Pu。

表1 葛根素-海藻酸鈣凝膠黏度測定結果cP

3.3凝膠最佳處方篩選 通過流變學方法表征凝膠流變學參數(shù)時，當黏性模量G”＞彈性模量G’時，溶液處于黏性液體狀態(tài)，當G’＞G”時表現(xiàn)為凝膠狀態(tài)[9]，凝膠的強度大小由G’決定。篩選最佳凝膠處方參考李凱[10]等研究結果，用于間充質干細胞培養(yǎng)的透明質酸凝膠最佳強度為G’略大于100 Pa。當CaCl2濃度≤6 mmol/L 時，G’與 G”大小相近，凝膠強度偏弱，達到8 mmol/L時，凝膠強度過大；SA濃度在0.55%～0.65%之間對凝膠強度影響不大，達到0.7%流變學參數(shù)變得不規(guī)律；Pu濃度≤0.1%時，對凝膠強度影響不明顯，葛根素濃度達到0.2%時對凝膠強度有明顯的促進作用，也證明了葛根素可能參與海藻酸鈣凝膠構建。在確保所得凝膠均一透明和可注射性前提下，篩選最佳凝膠處方為0.6%SA+6 mmol/L CaCl2+0.2%Pu。

3.4凝膠的顯微結構 根據(jù)圖4凝膠掃描電鏡結果可知，SA與Pu的混合物不具有明顯的網孔支架結構，而是呈現(xiàn)不規(guī)則的層狀碎片結構，含有0.2%Pu處方的凝膠中有Pu析出，存在與凝膠網孔壁上。處方中CaCl2濃度達到4 mmol/L即形成三維網孔支架結構，網孔單元直徑約為100 μm，分布規(guī)律，大小均一；當CaCl2濃度達到8 mmol/L時，凝膠網孔單元直徑減小至60 μm左右，孔隙率有所下降，由于凝膠強度較大，凍干凝膠平面切片時形成較多碎片。相比傳統(tǒng)2D培養(yǎng)，3D培養(yǎng)更貼近體生理條件，使細胞更好的表達出生理功能[11]，掃描電鏡結果說明，Pu-海藻酸鈣凝膠結構具有較大孔隙率，符合細胞3D培養(yǎng)的要求，能夠為細胞提供充足的生長空間，保證細胞的營養(yǎng)物質和氣體交換。

3.5凝膠體外溶脹、降解性質

圖1 不同濃度CaCl2條件下凝膠流變學參數(shù)

圖2 不同濃度SA條件下凝膠流變學參數(shù)

圖3 不同濃度Pu條件下凝膠流變學參數(shù)

圖4 凝膠的掃描電鏡圖

3.5.1凝膠體外溶脹結果 由圖5凝膠溶脹結果可知，無論是海藻酸鈣凝膠還是Pu-海藻酸鈣凝膠，在12 h溶脹平衡，海藻酸鈣凝膠溶脹率為75倍，Pu-海藻酸鈣凝膠的溶脹率為45倍。對于海藻酸鈣凝膠，強度弱則溶脹率大，Pu具有增加海藻酸鈣凝膠強度的作用，導致凝膠的溶脹率下降。凝膠溶脹率反映了凝膠的保水性和孔隙率，對于細胞的支架材料來說，要為細胞提供穩(wěn)定載體和營養(yǎng)物質交換條件，凝膠強度太大不利于營養(yǎng)物質交換，強度小則降解速度快。

3.5.2凝膠體外降解結果 在體外降解實驗中，Pu-海藻酸鈣凝膠均勻、透明，溶脹體積較小，而海藻酸鈣凝膠有白色片狀絮凝現(xiàn)象，溶脹體積較大。說明Pu-海藻酸鈣凝膠強度較大，凝膠狀態(tài)更穩(wěn)定。海藻酸鈣凝膠在12 d開始出現(xiàn)明顯降解，到第24天降解83.78%，Pu-海藻酸鈣凝在第24天開始降解，降解率僅為18.86%。對于負載細胞和藥物的關節(jié)原位注射凝膠，要求凝膠強度和降解周期與治療周期相符，體內關節(jié)腔環(huán)境比較復雜，一方面是生理環(huán)境，透明質酸能夠阻礙SA與Ca2+形成凝膠[12]，二是關節(jié)腔存在的機械力，對凝膠的降解也有促進作用。Pu-海藻酸鈣凝膠相比海藻酸鈣凝膠在溶脹、降解性質方面都具有明顯優(yōu)勢,Pu-海藻酸鈣凝膠更符合骨關節(jié)炎的治療要求。

圖5 凝膠的平均溶脹率曲線圖

表3 凝膠的體外平均降解率%

圖6 藥物釋放曲線（左：Pu，右：Tet）

3.6葛根素海藻酸鈣凝膠的體外藥物釋放 樣品通過HPLC進樣測定濃度，經過條件篩選，Pu流動相比例為0.1%磷酸水溶液：甲醇=1∶1，Tet流動相比例為0.1%磷酸水溶液：甲醇∶0.1%三乙胺乙腈溶液=0.1∶0.55∶0.35。采用標準品溶液得到濃度-積分面積標準曲線分別為 Pu：y=1.477×10-5-0.160，R2=0.99 9 8；Tet：y=5.458×10-5-0.065,R2=0.9999。

從藥物釋放結果看，Tet在24 h基本達到釋放平衡點，僅僅釋放藥物總量的53%，中性Tet在弱堿性水溶液中會以微晶體或亞微晶體析出，釋放完成后凝膠中可見析出的Tet藥物，所以Tet釋放藥物總量的53%。Pu的存在對Tet釋放基本無影響，對于海藻酸鈣凝膠，改變膠凝強度對于Mw≤20 000 Da藥物釋放基本無影響[13]。凝膠中Pu釋放速率較快，于12 h基本達到釋放平衡點，累積釋放率達到藥物總量的85.5%，首先葛根素有少量的降解[14]，由釋放曲線12 h到72 h結果可知，Pu在釋放條件下有少量降解。其次因為Pu的吸光度極易受pH值的影響，隨著pH值變大，Pu黃酮母核羥基容易電離，λmax發(fā)生明顯紅移[15]，紅移后在原λmax吸光度減小，此時測得Pu含量偏小。

4 討論

海藻酸鈣凝膠一般通過SA與不溶性鈣鹽緩慢釋放Ca2+交聯(lián)所得，SA與Ca2+能夠迅速發(fā)生物理交聯(lián)而膠凝化[16-17]，直接滴加法也只適用于制備凝膠粒子，粒子表面交聯(lián)強度大于內部[18]，實驗證明當Ca2+濃度小于7 mmol/L時，采用物理攪拌可以得到均一凝膠。以SA為主要材料構建Pu-海藻酸鈣凝膠具有以下優(yōu)勢，SA生物相容性良好；SA均為酸性多糖，關節(jié)滑液主要成分為透明質酸[19-20]，兩者性質相似[21]；骨關節(jié)炎患者滑液中透明質酸有明顯降低趨勢[20]，采用SA材料能夠改善此病理條件；有文獻報道SA能夠促進間充質干細胞向成骨細胞分化[22]；人體缺少SA相關降解酶，經關節(jié)注射后，SA在體內降解緩慢，比較適用骨關節(jié)炎這類慢性疾病。Pu-海藻酸鈣凝膠具有較高孔隙率，為細胞生長提供充足的空間，與海藻酸鈣凝膠相比，彈性模量G’較大、溶脹率下降、體外降解時間長，一致說明Pu對海藻酸鈣凝膠強度有促進作用，凝膠性質有所改善。負載粉防己堿凝膠表現(xiàn)出良好的藥物緩釋行為，24 h內釋放藥物總量的53%，未釋放藥物會隨著凝膠的緩慢降解逐漸釋放。綜上所述，Pu-海藻酸鈣凝膠有望成為骨關節(jié)炎治療的良好載體。

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