全 穎 ，梁鳳鳴，王 莉 ，王 燕 ，黎紅梅，關(guān)玉雙 ，王瑩瑩

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193 2.廣東省中醫(yī)院，廣東 510000）

脈絡(luò)膜新生血管（CNV）是濕性老年性黃斑變性（WAMD）區(qū)別干性老年性黃斑變性的主要特征，其發(fā)生是由于脈絡(luò)膜的病理性增殖血管突破Bruch膜，長(zhǎng)到視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）或視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層下，造成視網(wǎng)膜的滲出、出血甚至瘢痕，導(dǎo)致視力下降、視物變形、視野缺損等[1]。研究顯示，VEGF是公認(rèn)最強(qiáng)的促血管生成因子[2]?？筕EGF藥物治療CNV已成為時(shí)下最快速有效的治療手段之一[3]。而該治療方式價(jià)格昂貴，長(zhǎng)效性有待進(jìn)一步探究，推動(dòng)研究者去尋找更有效且不良反應(yīng)小的治療方案。杞黃顆粒方是梁鳳鳴教授總結(jié)臨床經(jīng)驗(yàn)而得，治療黃斑變性取得了確切的療效，故認(rèn)為其在治療CNV方面可發(fā)揮功用，改善AMD患者的生活質(zhì)量。本研究致力于觀察杞黃顆粒對(duì)BN大鼠VEGF蛋白含量及mRNA表達(dá)的影響，探討杞黃顆粒治療CNV的效果。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物及試劑 BN大鼠81只，雄性，體質(zhì)量200～250 g（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）、10%熒光素鈉注射液（廣州白云山明興制藥有限公司）、若丹明標(biāo)記的蓖麻子凝集素（Vector公司）、雷珠單抗注射液（Genentech公司）、VEGF抗體（Prteintech公司）等。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器 532 nm倍頻Ng：YAG激光機(jī)（Quantel·Medical公司）、LV-100激光共焦顯微鏡（Olympus公司）、光學(xué)相干斷層掃描（OCT，Heidelberg公司）等。

1.1.3藥物 杞黃顆粒（江蘇江陰藥業(yè)公司）由枸杞子、褚實(shí)子、茺蔚子、丹參等藥物組成。功效：補(bǔ)益肝腎，祛瘀明目等。雷珠單抗注射液（0.2 mL）：Genentech公司。

1.2動(dòng)物模型的制作 BN大鼠81只，隨機(jī)分組，13只為空白對(duì)照組，68只造模后驗(yàn)證，再分組。將68只大鼠麻醉（1%戊巴比妥腹腔注射，45 mg/kg），右眼散瞳，532 nm激光圍繞視盤1.5-2PD光凝，約10個(gè)點(diǎn)（功率300 mw，直徑 50 μm，曝光 0.05 S）。造模后第7天，68只大鼠中隨機(jī)選取3只，行OCT、熒光眼底造影（FFA）、激光共聚焦顯微鏡驗(yàn)證CNV形成。

1.3OCT和FFA檢測(cè) 隨機(jī)選取的3只大鼠予OCT、FFA以觀察CNV形態(tài)及滲漏情況。OCT采用視網(wǎng)膜顳側(cè)后極部和視盤中心連線的直線橫向線性掃描，長(zhǎng)度2.8 mm，深度2 mm。FFA在腹腔推注10%熒光素鈉1 mL/kg，使用海德堡眼底血管造影儀間斷拍攝。

1.4激光共焦顯微鏡檢測(cè)RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜鋪片的CNV 隨機(jī)選取的3只大鼠行OCT、FFA后，行過量麻醉，經(jīng)心臟灌注400 mL生理鹽水和400 mL 4%多聚甲醛，處死，摘除右眼球，固定并洗滌，去除多余組織，RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體做6～8個(gè)放射狀切口，置于TritonX-100中室溫24 h。與若丹明標(biāo)記的蓖麻子凝集素（1∶1 000）室溫下避光孵育24 h，洗滌后封片，觀察CNV并拍照。

1.5分組及給藥方法 造模后第7天，65只大鼠隨機(jī)分為5組：杞黃A組，給藥60天；杞黃B組，給藥90 d；雷珠單抗組；杞黃+雷珠組；模型組。每組13只。杞黃A組和杞黃B組和杞黃+雷珠組予杞黃顆粒灌胃，每日1次，藥量按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》[4]規(guī)定方法折算，不超過2 mL；模型組和空白對(duì)照組予生理鹽水灌胃，每日1次，用量折算方法同杞黃顆粒；雷珠單抗組和杞黃+雷珠組行右眼玻璃體腔注射雷珠單抗注射液，每次3 μL，每月1次，共3次。

1.6Westen-Blot檢測(cè)VEGF的蛋白含量 RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體用10倍體積的組織裂解液，提取蛋白，電泳，轉(zhuǎn)膜，加入VEGF多克隆抗體，4℃下孵育過夜，加入二抗室溫孵育1 h，應(yīng)用ECL顯色劑顯影，Lab Works TM凝膠成像分析系統(tǒng)攝像，分析各條帶的亮度值并繪制柱狀圖。

1.7RT-PCR檢測(cè)VEGF mRNA表達(dá)水平 依據(jù)Trizol試劑說明提取總RNA，取2 μL溶解RNA，紫外線光光分度法測(cè)定其純度及濃度后反轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增VEGF，同時(shí)擴(kuò)增β-actin作為內(nèi)參。應(yīng)用Primer 5.0軟件，設(shè)計(jì)上下游引物擴(kuò)增VEGF、βactin的部分CDS區(qū)（VEGF-S：5'-CACCACGCTCTT CTGTCTACTGAAC-3'，VEGF-AS：5'-TGCCACAAG CAGGAATGAG-3'，PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度應(yīng)為 117bp；βactin-S：5'-GCTATTTGGCGCTGGACTT-3'，β-actin-AS：5'-GCGGCTCGTAGCTCTTCTC-3'，PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度應(yīng)為78bp），運(yùn)用SYBR?Premix Ex Taq TM（TaKaRa）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。數(shù)據(jù)處理：Folds=2-ΔΔCt。

1.8統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。除治療后杞黃顆粒不同時(shí)間點(diǎn)VEGF mRNA的比較，選用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)外；其余各組治療之間比較用非參數(shù)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1OCT和FFA檢查結(jié)果 OCT圖像示：脈絡(luò)膜不規(guī)則增厚，色素上皮下可見團(tuán)塊狀或條形或不規(guī)則形狀的高反射，為CNV（見圖1）；激光斑位置視網(wǎng)膜色素上皮層中斷，周圍呈現(xiàn)環(huán)形或不均勻反射信號(hào)（見圖2）。FFA結(jié)果顯示：早期可見激光及周邊呈現(xiàn)低熒光，部分中期可見點(diǎn)、片狀或不規(guī)則高熒光，晚期部分滲漏明顯，可見片狀、盤狀或不規(guī)則高熒光。大量滲出時(shí)伴有大片圓形或不規(guī)則遮蔽熒光，邊界不清晰，提示有眼底出血（見圖3）。

圖1 OCT檢查結(jié)果1

圖2 OCT檢驗(yàn)結(jié)果2

圖3 FFA檢查結(jié)果

2.2共焦結(jié)果 造模后鋪片可見團(tuán)簇狀或條帶狀或不規(guī)則形狀熒光，顯示區(qū)域多于50%時(shí)，則認(rèn)為CNV（見圖 4）。

圖4 共焦檢查結(jié)果

2.3VEGF的蛋白含量的變化 以60 d各組VEGF蛋白含量為檢驗(yàn)對(duì)象，不符合正態(tài)性分布，予非參數(shù)檢驗(yàn)，結(jié)果示：模型組和空白組的VEGF蛋白含量對(duì)比明顯增多，P＜0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。杞黃A組、雷珠單抗組相比模型組，雷珠單抗組相比杞黃A組，杞黃+雷珠組相比雷珠單抗組，VEGF的蛋白含量均有所降低，但P＞0.05，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；杞黃+雷珠組相比模型組VEGF的蛋白含量有所降低，P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；杞黃+雷珠組相比杞黃A組VEGF的蛋白含量明顯降低，P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見圖5、圖6、表1和表2。

以不同時(shí)間點(diǎn)兩組VEGF蛋白含量為檢驗(yàn)對(duì)象，不符合正態(tài)性分布，予非參數(shù)檢驗(yàn)，結(jié)果示：杞黃B組相比杞黃A組的VEGF蛋白含量有所降低，P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4VEGF mRNA表達(dá)水平的變化 以60 d各組VEGF mRNA為檢驗(yàn)對(duì)象，不符合正態(tài)性分布，予非參數(shù)檢驗(yàn)，結(jié)果示：與空白對(duì)照組相比，模型組VEGF mRNA表達(dá)水平均明顯增加，P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。杞黃A組、雷珠單抗組相比模型組，雷珠單抗組相比杞黃A組，VEGF mRNA有所降低，但P＞0.05，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。杞黃+雷珠組相比模型組VEGF mRNA有所降低，P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表3和表4。

圖5 60 d各組RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體中VEGF蛋白含量的表達(dá)

圖6 杞黃A組與杞黃B組VEGF蛋白含量的表達(dá)

表1 60 d各組RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體中VEGF蛋白含量的表達(dá)（±s）

表1 60 d各組RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體中VEGF蛋白含量的表達(dá)（±s）

注：＃表示兩兩比較時(shí)，與模型組對(duì)比具有顯著性差異，P＜0.05；*表示兩兩比較時(shí)，與杞黃+雷珠組對(duì)比具有顯著性差異，P＜0.05。

組別 n 蛋白含量空白對(duì)照組 13 552.00±331.98＃模型組 13 1 557.25±493.14杞黃A組 13 1 506.92±516.40*雷珠單抗組 13 1 199.67±393.57杞黃+雷珠組 13 857.25±321.55＃

表2 杞黃A組與杞黃B組VEGF蛋白含量的表達(dá)（±s）

表2 杞黃A組與杞黃B組VEGF蛋白含量的表達(dá)（±s）

注：*表示與杞黃A組對(duì)比具有顯著性差異（P＜0.05)。

組別 n 蛋白含量杞黃A組 13 821.83±334.11杞黃B組 13 560.17±288.20*

表360 d各組VEGFmRNA 表達(dá)（±s）

表360 d各組VEGFmRNA 表達(dá)（±s）

注：*:表示兩兩比較時(shí)，與模型組對(duì)比具有顯著性差異（P＜0.05）。

組別 n mRNA空白對(duì)照組 13 20.12±0.55*模型組 13 18.25±0.80杞黃A組 13 18.77±0.66雷珠單抗組 13 19.19±0.57杞黃+雷珠組 13 19.65±0.58*

表4 杞黃A組與杞黃B組VEGF mRNA表達(dá)（±s）

表4 杞黃A組與杞黃B組VEGF mRNA表達(dá)（±s）

注：*：表示與杞黃A組對(duì)比具有顯著性差異（P＜0.05）。

分組 動(dòng)物數(shù) mRNA杞黃A組 13 32.81±0.13杞黃B組 13 33.46±0.20*

以不同時(shí)間點(diǎn)兩組VEGF mRNA為檢驗(yàn)對(duì)象，符合正態(tài)性分布，采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，結(jié)果示：杞黃B組相比杞黃A組的VEGF mRNA有所降低，P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

CNV是諸多眼部疾病的主要病理特征，如WAMD、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、息肉樣脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變、高度近視等疾病[5]。CNV的結(jié)構(gòu)與功能的異常，伴有視網(wǎng)膜的滲出、出血等病變，對(duì)視力和視覺造成嚴(yán)重的沖擊。有研究認(rèn)為CNV形成與缺氧、炎癥等相關(guān)，主要是血管生長(zhǎng)因子與血管抑制因子之間的抗衡[6]。VEGF作為主導(dǎo)刺激因子，能夠增加血管的滲透性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞趨化、遷移，降解細(xì)胞外基質(zhì)，為血管形成提供條件，誘導(dǎo)WAMD發(fā)病，故國(guó)際臨床指南多推薦抗VEGF為治療WAMD的一線治療[7]。當(dāng)前抗VEGF的臨床研究主要分為2個(gè)方面：1）是競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合VEGF受體，阻滯VEGF與其受體結(jié)合，抑制VEGF表達(dá)，減少CNV形成。如雷珠單抗，是一種人源化單克隆抗體片段，靶向抑制人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A與其受體的結(jié)合，有效減少VEGF表達(dá)，該藥治療經(jīng)典型或隱匿型WAMD經(jīng)三期（隨機(jī)、雙盲、對(duì)照）臨床研究證明，玻璃體腔注射該藥可有效提高多數(shù)患者的視力，抑制CNV的生成，控制WAMD的進(jìn)程，并于2013年獲得批準(zhǔn)，用于治療CNV致病[8-11]。2）是阻擋VEGF與受體結(jié)合后信號(hào)通路下游相關(guān)激酶的表達(dá)，削弱VEGF的作用，如X-82（中國(guó)代號(hào)CM082），是一種酪氨酸激酶抑制劑，通過抑制VEGF受體和PDGF受體，阻斷CNV的形成，前期應(yīng)用于抗腫瘤和新生血管。X-82是全球首個(gè)治療WAMD的口服藥，2015年其臨床試驗(yàn)進(jìn)入臨床IIb期，尚未批準(zhǔn)使用[12-14]。綜合考慮，雷珠單抗治療WAMD效果明顯且安全性高，認(rèn)為是當(dāng)前行之有效的選擇。

《靈樞·邪氣臟腑病形篇》[15]中認(rèn)為：十二經(jīng)脈，三百六十五絡(luò)，其氣血皆上于面而走空竅，其精陽氣上走于目而為之睛。《審視瑤函》[16]中則曰：目，內(nèi)有大絡(luò)者五，乃心、肝、脾、肺、腎各主一絡(luò)……通乎血?dú)馔鶃硪宰棠?。眼睛與各臟腑、經(jīng)絡(luò)關(guān)系密切，氣血正常運(yùn)行得以明視物。近代眼科大家陳達(dá)夫先生依據(jù)內(nèi)眼與臟腑經(jīng)絡(luò)的關(guān)系，提出“中醫(yī)眼科六經(jīng)法要之說[17]”，認(rèn)為視網(wǎng)膜屬于足厥陰肝經(jīng)，而視網(wǎng)膜黃斑區(qū)屬于足太陰脾經(jīng)，眼內(nèi)一切色素屬于腎經(jīng)。WAMD患者多年邁體弱，素體肝血不足，目視不明，腎氣不固，瞳神失養(yǎng)，久病致脈絡(luò)氣血虧虛，不能上榮于目，目珠失于涵養(yǎng)。若脾虛失常，津液不能輸布，聚濕成痰，痰濁傷于黃斑，氣血溢于脈外，脈絡(luò)瘀阻閉塞，久絡(luò)傷血，更加影響視物功能，故本病特點(diǎn)為因虛生痰，由虛致瘀，痰瘀互結(jié)，虛實(shí)夾雜,與肝脾腎緊密相關(guān)，治宜從肝脾腎入手,審證求因，區(qū)分虛實(shí)，健脾滋補(bǔ)肝腎同時(shí)祛瘀通絡(luò)活血。杞黃顆粒經(jīng)過多年臨床證明在治療干性肝腎陰虛型老年性黃斑變性上有顯著療效[18]，方由枸杞子、褚實(shí)子、茺蔚子、丹參等組成。枸杞子入肝腎經(jīng)，作用為滋補(bǔ)肝腎，養(yǎng)血明目。褚實(shí)子入肝腎經(jīng)，功能為補(bǔ)腎益精，利水消腫。茺蔚子入心包、肝經(jīng)，功效為養(yǎng)肝明目，活血通經(jīng)。三者合為君藥，既補(bǔ)益肝腎之不足，又能夠通經(jīng)活血以消散脈絡(luò)之瘀阻，補(bǔ)虛泄實(shí)，標(biāo)本兼顧。

總之，杞黃顆粒經(jīng)證實(shí)治療干性AMD確有明顯的療效[18-20]，而本實(shí)驗(yàn)在其對(duì)治療WAMD的研究中發(fā)現(xiàn)，60 d的干預(yù)上杞黃顆粒對(duì)VEGF的調(diào)控作用不明顯，但經(jīng)過90 d的對(duì)比后，其呈現(xiàn)出逐步增效的趨勢(shì)，且與雷珠單抗聯(lián)合使用時(shí)表現(xiàn)出明確下調(diào)VEGF表達(dá)的效果，治療WAMD有一定的意義，值得進(jìn)一步探究。

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