王金艷 ，任 靜 ，陳世彬 ，姚少姿 ，馬 麗 ，劉志東

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程中心，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，天津 300193；3.華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，深圳 518110）

達(dá)原飲出自明代醫(yī)家吳有性的《溫疫論》，由檳榔、厚樸、草果、知母、白芍、黃芩、甘草7味中藥組成，具有開達(dá)膜原，辟穢化濁的功效，主治瘟疫或瘧疾邪伏膜原之證[1]。方中檳榔為君藥，辛散濕邪；草果辛香化濁，厚樸芳香化濁，共為臣藥；佐白芍、知母清熱滋陰，佐黃芩清熱燥濕；甘草為使藥，既能清熱解毒，又能調(diào)和諸藥[2]。從達(dá)原飲的現(xiàn)代臨床應(yīng)用看，其適應(yīng)癥十分廣泛，然而都離不開共同的病機，即“膜原證”，常用于各種發(fā)熱、盜汗、扁桃體炎、便秘、淋證、腹脹等多種疾病[3-6]，療效頗佳。目前達(dá)原飲質(zhì)量控制方面的研究較少，有文獻(xiàn)報道[7]，針對達(dá)原飲相關(guān)制劑中1個或2個成分（如黃芩苷）進(jìn)行含量測定來控制制劑質(zhì)量。但中藥復(fù)方中成分復(fù)雜，單一指標(biāo)成分的含量測定難以較全面控制質(zhì)量，有必要結(jié)合達(dá)原飲處方藥味特點，建立多指標(biāo)成分的含量控制方法。本實驗采用高效液相色譜法（HPLC）在同一色譜條件下同時測定達(dá)原飲中芒果苷等6種活性成分含量的方法，旨在為達(dá)原飲制劑的開發(fā)提供一種更全面的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與材料

1.1儀器 Agilent1260高效液相色譜儀（四元泵，VWD檢測器，自動進(jìn)樣器，OpenLAB工作站，美國安捷倫公司）；Sorvall ST16R高速離心機（德國Thermo Scientific公司）；Milli-Q超純水機（德國Millipore公司）；Mettler Toledo XP205電子分析天平（Mettler Toledo儀器有限公司）；FA 124型天平（上海舜宇恒平有限公司）。

1.2試劑 黃芩苷（批號110715-201318）、芍藥苷（批號 110736-201438）、芒果苷（批號 111607-200402）、甘草酸銨（批號 110731-201418）、厚樸酚（批號110729-200412）、和厚樸酚（批號110730-201313）對照品由中國食品藥品檢定研究院提供。甲醇、乙睛均為色譜純，F(xiàn)isher scientific公司；水為超純水，磷酸為色譜純，購于天津光復(fù)精細(xì)化工研究所。檳榔、厚樸、草果、知母、白芍、黃芩、甘草的藥材信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測波長為230 nm，柱溫 30 ℃，流速 0.8 mL/min，進(jìn)樣量 10 μL，流動相為乙腈（A）-0.2%磷酸水（B）進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序見表2。

表1 藥材來源

表2 梯度洗脫程序表

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液的制備 精密稱取芒果苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸銨、厚樸酚、和厚樸酚對照品適量，加甲醇制成濃度分別為:158.20、336.82、1478.99、90.30、17.18、5.37 mg/L 混合對照品儲備液。分別精密量取 0.5、1、2、4、5、6、10 mL 儲備液置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制得系列混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 按處方稱取上述7味藥材置2 L的煎藥壺中，加適量水，浸泡，加蓋煎煮，濾除藥渣，得濾液；精密量取濾液5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，取適量12 000 r/min離心10 min，取上清液，即得。

2.3系統(tǒng)適應(yīng)性實驗 分別精密吸取混合對照品溶液及供試品溶液10 μL，按“2.1”項色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果6種被測成分均能達(dá)到基線分離，與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以各色譜峰計均超過10 000，峰形較好。HPLC色譜圖見圖1。

2.4線性關(guān)系考察 在“2.1”項色譜條件下，分別吸取系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。分別按照色譜條件依次進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果見表3。

圖1 6種混合對照品溶液（A）和供試品溶液（B）HPLC色譜圖

表3 6種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.5精密度 取混合對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣體積為10 μL，以對照品峰面積進(jìn)行計算，芒果苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸、厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD分別為1.34%、1.89%、1.55%、0.70%、1.44%、1.64%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性 取供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件操作，分別在 0、2、4、8、16、24、36 h 進(jìn)樣，測定芒果苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸、和厚樸酚、厚樸酚的峰面積，按峰面積計算得RSD%分別為0.31%、0.83%、0.54%、1.79%、1.11%、1.79%，結(jié)果表明供試品溶液在室溫條件下放置36 h穩(wěn)定性良好。

2.7重復(fù)性 取同一批達(dá)原飲煎液，按“2.2.2”項下方法操作，制備供試品溶液6份，精密吸取溶液10 μL，按"2.1”項下色譜條件測定，分別測得芒果苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸、和厚樸酚、厚樸酚含量的RSD分別為0.22%、1.02%、0.36%、0.96%、0.32%、0.38%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.8回收率 精密移取同一批達(dá)原飲藥液2.5 mL，共9份，分別精密加入高、中、低3個水平的芒果苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸銨、厚樸酚、和厚樸酚對照品，每個水平3份，按"2.2.2”項下方法操作，制備供試品溶液并進(jìn)樣分析。結(jié)果芒果苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸、和厚樸酚、厚樸酚的平均回收率分別為102.2%、98.6%、100.7%、97.5%、99.3%、101.1%，RSD分別為1.83%、1.61%、1.68%、1.30%、1.67%、1.91%。

2.9樣品測定 分別稱取處方量的上述7味藥材置2 L的煎藥壺中，按“2.2.2”項下方法操作，制備供試品溶液，平行6份，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，并計算樣品中6種指標(biāo)成分的含量，結(jié)果見表4。

表4 達(dá)原飲中芒果苷等6種有效成分的含量（n=6）

結(jié)果表明，同一產(chǎn)地、同一批次的6份達(dá)原飲煎液中各個指標(biāo)的含量存在一定的差異，分析可能與制備煎液的藥味處方量少、藥材飲片規(guī)格、大小不一等有關(guān)。

3 討論

達(dá)原飲由檳榔、厚樸、草果、知母、白芍、黃芩、甘草7味藥材組成，參照藥典及文獻(xiàn)[8-16]，其主要指標(biāo)性成分分別為檳榔堿、厚樸酚、和厚樸酚、芒果苷、知母皂苷BⅡ、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸。檳榔堿為小分子生物堿，在C18柱上幾乎無保留[17]，而知母皂苷BⅡ為紫外區(qū)末端吸收[18-19]，由于紫外檢測器的檢測范圍的有限性、常用C18柱的選擇性都不足以同時對上述所有指標(biāo)成分進(jìn)行定量分析，因此采用廣泛使用的反相高效液相色譜紫外法（HPLCUV）選擇其中6種主要活性成分進(jìn)行含量測定。

分別考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸溶液梯度洗脫作為流動相，發(fā)現(xiàn)乙腈-水、甲醇-水作為流動相時，芍藥苷拖尾嚴(yán)重，而乙腈作有機相的分離效果更好，采用乙腈-0.1%磷酸水溶液作流動相，各峰的保留時間合適且拖尾現(xiàn)象有一定改善，進(jìn)一步加大流動相中酸的含量，用0.2%磷酸代替0.1%磷酸，拖尾現(xiàn)象顯著改善，提高了分析靈敏度，故選定其為流動相。

本實驗根據(jù)掃描供試品溶液200～400 nm的二極管陣列檢測器（DAD）的光譜譜圖，確定幾個較好的檢測波長，分別為 215、230、254、280、294 nm，采用HPLC進(jìn)行單個波長測定，綜合考慮色譜峰峰高和分離度，可知在波長230 nm下為最佳，最終確定最佳檢測波長為230 nm。

厚樸作為方中臣藥，其主要活性成分厚樸酚、和厚樸酚在達(dá)原飲中的含量較低，分析原因在于厚樸酚、和厚樸酚均為脂溶性成分[20]，在水中的溶解度小，而達(dá)原飲煎液采用水作為溶劑提取，因此煎液中厚樸酚、和厚樸酚含量低。黃芩苷作為黃芩的主要活性成分，在達(dá)原飲中的含量高。黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，在方中發(fā)揮著重要的作用。

本實驗建立的HPLC方法可快速定量測定達(dá)原飲中的6種主要藥效成分。本方法簡單、靈敏、準(zhǔn)確、精密度高，為達(dá)原飲的全面質(zhì)量控制提供更為可靠的保證。

[1]浙江省中醫(yī)研究所.《溫疫論》評注[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1977:23.

[2] 肖 勇,劉英鋒.試論檳榔、草果、厚樸在達(dá)原飲中的配伍意義[J].江西中醫(yī)藥,2014,45(10):11-12.

[3] 郭玉紅,巫熙南,巫浣宜.達(dá)原飲、四逆散治療發(fā)熱案[J].山東中醫(yī)雜志,2014,33(2):147-148.

[4] 崔利敏.達(dá)原飲灌腸聯(lián)合西藥治療化膿性扁桃體炎隨機平行對照研究[J].實用中醫(yī)內(nèi)科雜志,2015,29(2):105-107.

[5] 顏林鈞,馬鴻杰,李康康.柴葛解肌湯合達(dá)原飲治療淋證驗案1則[J].湖南中醫(yī)雜志,2015,31(9):103-104.

[6] 梁自平,馮漢財.達(dá)原飲治療濕阻便秘經(jīng)驗略談[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2010,16(10):227.

[7] 宋 茹,遲歸兵.達(dá)原飲膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中成藥,2010,30(8):附 9-附 11.

[8] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:365.

[9] Huang JL,Michael J.High-performance liquid chromatographic determination of the alkaloids in betel nut[J].J Chromatogr,1989,475:447-450.

[10]楊 華,郭元滿,譚澤云,等.HPLC法同時測定四磨湯滴丸中辛弗林、檳榔堿和去甲異波爾定的含量[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報,2016,22(2):40-43.

[11]韓 亮,石忠峰,林華慶,等.UPLC/Q-TOF-MS/MS法分析厚樸化學(xué)成分[J].中成藥,2013,35(4):766-769.

[12]莊 麗,劉 威,張振秋,等.HPLC法同時測定黃芩、白芍藥對提取物中8種指標(biāo)成分的含量[J].中國新藥雜志,2012,21(12):1422-1426.

[13]梁 雷,邊寶林,王宏潔,等.不同產(chǎn)地知母藥材中芒果苷和知母皂昔BⅡ的含量測定[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2010,16(16):49-51.

[14]趙路路,劉菲菲,彭 纓,等.高效液相色譜法考察不同炮制方法對知母中5種主要化學(xué)成分的影響[J].色譜,2012,30(12):1271-1275.

[15]劉雅茜,王夢月,史海明,等.高效液相色譜法測定甘草及其炮制品中5種活性成分的含量[J].中國藥學(xué)雜志,2008,43(16):1268-1271.

[16]朱如彩,蔡 萍,李 雅,等.不同產(chǎn)地白芍HPLC指紋圖譜及芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷含量的比較研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2012,32(3):34-37.

[17]毛春芹,陸兔林,季 德,等.高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地大腹皮中檳榔堿的含量[J].中國藥學(xué)雜志,2013,48(11):909-911.

[18]孫穎光,生 寧,支旭然,等.高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定知柏地黃丸中新芒果苷等9種成分的含量[J].中國藥學(xué)雜志,2014,49(2):152-155.

[19]鐘 可,王文全,靳鳳云,等.HPLC-ELSD法同時測定河北產(chǎn)道地藥材不同物候期知母中知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ的含量[J].中華中醫(yī)藥雜志,2013,28(6):1710-1713.

[20]孟 超,吳 豐,馬 林,等.厚樸類中藥厚樸酚及和厚樸酚含量測定[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2007,19(6):1024.