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        釀酒酵母胞內(nèi)物質(zhì)提取工藝優(yōu)化

        2018-03-02 18:42:36王周利高振鵬
        農(nóng)產(chǎn)品加工 2018年4期
        關(guān)鍵詞:效果

        尚 磊,王周利,高振鵬

        (1.寶雞市特種設(shè)備檢驗(yàn)所,陜西寶雞 721000;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西楊凌 712100)

        釀酒酵母廣泛應(yīng)用于生活中,在食品生產(chǎn)中也得到了廣泛的利用,如饅頭的發(fā)酵、面包的生產(chǎn)、醬油的生產(chǎn)等,不僅在食品生產(chǎn)中得到了應(yīng)用,在工業(yè)生產(chǎn)中也得到了廣泛應(yīng)用,包括工業(yè)生產(chǎn)乙醇、生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白等方面[1-5]。對(duì)釀酒酵母胞內(nèi)物質(zhì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,利用有機(jī)試劑提取,對(duì)胞內(nèi)物質(zhì)淬滅、提取條件進(jìn)行優(yōu)化,旨在為提高釀酒酵母胞內(nèi)物質(zhì)提取的利用率提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)菌株、試驗(yàn)試劑

        釀酒酵母,由實(shí)驗(yàn)室提供。

        葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉,以上均為分析純,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供;甲醇,色譜純,天津科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心提供;高氯酸、乙醇,分析純,天津市化學(xué)試劑一廠(chǎng)提供。

        1.2 主要儀器與設(shè)備

        滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)產(chǎn)品;離心機(jī),美國(guó)Labconco公司產(chǎn)品;水浴鍋,上海司樂(lè)儀器廠(chǎng)產(chǎn)品;分光光度計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,日本島津公司產(chǎn)品。

        1.3 培養(yǎng)基及試劑的配制

        (1) 培養(yǎng)基的配制。菌株的培養(yǎng)采用YPD培養(yǎng)基;將配制好后于120℃條件下滅菌20 min,待用。

        (2)試劑的配制。40%,60%,80%甲醇淬滅試劑;高氯酸提取試劑、沸乙醇提取試劑、純甲醇提取試劑。

        2 試驗(yàn)方法

        2.1 菌株的活化

        將凍存的甘油管的釀酒酵母用YPD培養(yǎng)基活化,完成第2次活化后待用[6-8]。

        2.2 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

        將活化好的菌種以2%的比例用移液槍接種到已滅菌的培養(yǎng)基中,于28℃條件下發(fā)酵培養(yǎng),分別培養(yǎng)至 0,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,24 h后取樣,利用分光光度計(jì)測(cè)定OD值。每次調(diào)零時(shí)均用未接種的培養(yǎng)基調(diào)零,以減小誤差,并記錄數(shù)據(jù)。

        2.3 樣品的淬滅

        采用3種淬滅試劑淬滅,即40%,60%,80%甲醇淬滅試劑。取對(duì)數(shù)期的菌液5 mL加入預(yù)冷的淬滅試劑中,于-20℃條件下淬滅30 min,然后以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心5 min,然后用相同的淬滅試劑清洗2次,離心得到的沉淀用提取試劑提取[9-13]。

        2.4 樣品提取

        樣品經(jīng)過(guò)淬滅后,采用高氯酸提取法、冷甲醇反復(fù)凍融、沸乙醇提取3種方法提取。

        (1) 用5 mL 10%(V/V) 高氯酸重懸酵母菌體,放入液氮中,然后在冰浴上解凍,反復(fù)3次。離心、吸取上清液,用10 mol/L的KOH溶液中和至pH值為7;離心、去沉淀,吸取上清液冷凍干燥。

        (2) 2 mL的純甲醇懸浮淬滅的酵母泥,在液氮中反復(fù)凍融3次,離心吸取上清液,再次用純甲醇清洗,渦旋振蕩30 s,合并2次上清液,冷凍干燥。

        (3)5 mL沸乙醇溶液重懸淬滅后的酵母菌體。于90℃水浴中保溫3 min,隨后立即放入冰浴冷卻3 min;離心后吸取上清液,冷凍干燥。

        2.5 硅烷化衍生

        酵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)淬滅提取、冷凍干燥得到的粉末,由于較多的代謝物含有極性官能團(tuán),并且其具有不穩(wěn)定性和不揮發(fā)性,在上機(jī)測(cè)定前需要硅烷化衍生,從而有利于代謝物分子結(jié)構(gòu)的確定。根據(jù)需要,以吡啶作為溶劑,乙氧基胺作為污化試劑,MSTFA作為硅烷化試劑,進(jìn)行衍生反應(yīng),污化衍生90 min,硅烷化衍生30 min,衍生溫度40℃。

        2.6 氣相色譜-質(zhì)譜條件

        (1)色譜柱。DB-17MS毛細(xì)管色譜柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm);采用自動(dòng)進(jìn)樣,進(jìn)樣口溫度300℃,載氣為He(純度99.99%),不分流進(jìn)樣,流量1 mL/min,進(jìn)樣體積1 μL。

        (2) 程序升溫。起始溫度為100℃,保持2 min,以5℃/min的速度升溫至200℃,再以10℃/min的速度升溫至300℃,保持3 min。

        (3)質(zhì)譜條件。電子轟擊電離(EI),電子能量70 eV,離子源溫度250℃,接口溫度280℃,質(zhì)量掃描范圍 50~500 m/z。

        3 結(jié)果與分析

        3.1 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

        對(duì)酵母細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)提取檢測(cè),各個(gè)時(shí)期不一樣,一般選取微生物生長(zhǎng)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài),選取對(duì)數(shù)后期或者穩(wěn)定期可以可靠反應(yīng)微生物的代謝情況。

        釀酒酵母生長(zhǎng)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

        圖1 釀酒酵母生長(zhǎng)曲線(xiàn)

        由圖1可以看出,釀酒酵母生長(zhǎng)速度較快,從適應(yīng)期開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期僅僅用了將近10 h的時(shí)間,在2~8 h,釀酒酵母處于對(duì)數(shù)期,此時(shí)期酵母快速生長(zhǎng),在10 h之后趨于穩(wěn)定,為了提取釀酒酵母的胞內(nèi)物質(zhì),根據(jù)圖1選擇12 h取樣,12 h后基本趨于穩(wěn)定,方便下一步研究。

        3.2 代謝組淬滅的優(yōu)化

        對(duì)不同的方法淬滅,文獻(xiàn)已有報(bào)道,根據(jù)試驗(yàn)需要,采用不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇水溶液進(jìn)行淬滅,經(jīng)過(guò)40%,60%,80%的甲醇水溶液淬滅后,采用冷甲醇-反復(fù)凍融提取的方法,采用GC-MS進(jìn)行評(píng)價(jià)。

        40%的甲醇水溶液淬滅的GC-MS離子流色譜見(jiàn)圖2,60%的甲醇水溶液淬滅的GC-MS離子流色譜見(jiàn)圖3,80%的甲醇水溶液淬滅的GC-MS離子流色譜見(jiàn)圖4。

        圖2 40%的甲醇水溶液淬滅的GC-MS離子流色譜

        圖3 60%的甲醇水溶液淬滅的GC-MS離子流色譜

        選用不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇水溶液(40%,60%,80%)對(duì)穩(wěn)定期的釀酒酵母淬滅,在硅烷化衍生后采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)其效果評(píng)估,從提取的數(shù)量上來(lái)看,60%的甲醇水溶液淬滅效果最好,提取物質(zhì)最多,達(dá)到82種,分別由40%,60%,80%的甲醇水溶液作淬滅試劑,純冷甲醇為提取試劑,采用GC-MS評(píng)價(jià)其效果,3種得到的代謝物數(shù)量分別為61,78,51 種。

        圖4 80%的甲醇水溶液淬滅的GC-MS離子流色譜

        不同體積分?jǐn)?shù)淬滅試劑提取的物質(zhì)種類(lèi)見(jiàn)表1。

        表1 不同體積分?jǐn)?shù)淬滅試劑提取的物質(zhì)種類(lèi)/個(gè)

        由表1可以看出,不同的物質(zhì)種類(lèi)數(shù)量組成,60%的甲醇水溶液淬滅效果最好,所以選擇此試劑作為最優(yōu)淬滅試劑。

        3.3 不同提取試劑的優(yōu)化

        上述試驗(yàn)確定了60%的甲醇水溶液作為最優(yōu)淬滅試劑,此試驗(yàn)采用高氯酸、純甲醇、沸乙醇作為提取試劑,以此來(lái)提取釀酒酵母胞內(nèi)物質(zhì),并采用GC-MS對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià),并對(duì)檢測(cè)到的物質(zhì)進(jìn)行歸類(lèi)匯總。

        不同提取方法代謝物見(jiàn)表2。

        表2 不同提取方法代謝物/個(gè)

        由表2可以看出,3種提取試劑中高氯酸提取效果最差,純甲醇和沸乙醇效果較好,純甲醇的提取物質(zhì)達(dá)到83種,效果最好,甲醇具有一定的極性,沸乙醇提取的效果僅次于純甲醇的效果,由于實(shí)際操作中,沸乙醇具有揮發(fā)性,對(duì)于提取的物質(zhì)的定量計(jì)算有一定的影響,因此選擇純甲醇作為提取試劑。

        4 結(jié)論

        通過(guò)比較酵母胞內(nèi)物質(zhì)淬滅與提取的方法,不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇水溶液作為淬滅試劑,然而在60%體積分?jǐn)?shù)下,淬滅效果最佳。在3種提取試劑中,沸乙醇和冷甲醇效果較好,但根據(jù)實(shí)際需要,選用效果最好的冷甲醇作為提取試劑,以利下一步的研究。

        [1] 陳洪奇,于欣水,張明明,等.硫酸鋅添加對(duì)釀酒酵母乙酸脅迫條件下全局基因轉(zhuǎn)錄的影響 [J].微生物學(xué)通報(bào),2017,44(6):1 312-1 321.

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