顧麗華，楊 帆，梅興林，周懷谷,

（1.上海市公安局物證鑒定中心，法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市現(xiàn)場(chǎng)物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200083；2. 無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司，江蘇 無(wú)錫214174）

司法鑒定中，常染色體和Y染色體的STR基因座檢測(cè)已成為常規(guī)手段。Y染色體呈父系、單倍型遺傳，故在父系親緣鑒定中有重要作用。在一些父系家族的親權(quán)鑒定、混合斑男性成分的檢測(cè)、不同男性個(gè)體混合物的分析等當(dāng)中，聯(lián)合應(yīng)用常染色體及Y染色體的STR分型技術(shù)會(huì)起到關(guān)鍵作用[1-6]。為減輕工作量、節(jié)約成本、縮短檢測(cè)時(shí)間，進(jìn)一步滿足司法鑒定需求，15個(gè)常染色體與18個(gè)Y染色體STR基因座以及性別基因座的復(fù)合檢測(cè)體系被建立，本文對(duì)此報(bào)道并評(píng)價(jià)其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 樣品

本實(shí)驗(yàn)室法庭科學(xué)DNA數(shù)據(jù)庫(kù)建庫(kù)的無(wú)關(guān)個(gè)體血樣800份，其中400份用Chelex-100提取，另400份用于直接擴(kuò)增（取樣直徑 1 mm）。購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的豬、牛、羊、雞、鴨、魚血用于種屬特異性檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)DNA：9947A (女性DNA)，9948 (男性DNA)?；旌蠘悠罚?948與9947A混合比為1：1、1：2、1：4、1：9、1：19。刑事案件檢材38份，其中血斑8份，煙蒂21份，肋軟骨5份，精斑4份。含抑制劑（血紅素、血紅蛋白和腐殖酸）的模板DNA。

1.2 主要儀器及試劑

自動(dòng)提取工作站 (瑞士TECAN公司)，DB-100A全自動(dòng)打孔機(jī)，美國(guó)AB公司的9700型PCR擴(kuò)增儀與3500遺傳分析儀。美國(guó)AB公司的Sinofi ler試劑盒、Identi fi ler-plus試劑盒和Y- fi ler試劑盒，以及無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司的AGCU Y-24試劑盒。

1.3 復(fù)合擴(kuò)增體系的建立

1.3.1 基因座的選擇

選定國(guó)內(nèi)外行業(yè)通用的Identi fi ler-plus的所有基因座和Y- fi ler中的16個(gè)基因座（減去DYS437），增加AGCU Y-24試劑盒中的DYS527基因座（見表 1）。

表1 15個(gè)常染色體和18個(gè)Y染色體的STR基因座復(fù)合直擴(kuò)體系中各基因座Table 1 Information of 15 autosomal and 18 Y STR loci in the multiplex PCR direct ampli fi cation kit

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)和合成

根據(jù)引物系統(tǒng)的靈敏度、均衡性、適用性要求，試劑盒采用六色熒光：第一組D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、DYS527、DYS448， 引 物用FAM 標(biāo) 記；第 二 組DYS456、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、DYS385、DYS458， 引 物用HEX標(biāo)記；第三組DYS391、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、DYS390，引物采用TAMRA標(biāo)記；第 四 組 Amel、D8S1179、D5S818、DYS19、FGA、DYS438，引物用ROX標(biāo)記；第五組DYS393、DYS389Ⅰ、DYS439、DYS389Ⅱ、DYS392、GATA_H4、DYS635，引物用VIG標(biāo)記；第六組是內(nèi)標(biāo)，用SIZ標(biāo)記。

1.3.3 復(fù)合擴(kuò)增體系的建立和優(yōu)化

PCR擴(kuò)增體系為20 μ L，含PCR反應(yīng)液8.0 μ L、引物液 0.6 μ L、熱啟動(dòng) Taq 酶 0.6 μL、模板DNA 液 10.8 μ L (含 H2O) 。

擴(kuò) 增 程 序：95 ℃ ×11 min，94 ℃ ×45 s，55℃×1 min，72℃×1 min，33個(gè)循環(huán)，60℃×60 min，4℃保溫。

1.3.4PCR產(chǎn)物的檢測(cè)

采用ABI3500型遺傳分析儀及 Gene Mapper ID-X軟件對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和分型。

1.4 檢測(cè)體系性能指標(biāo)驗(yàn)證

1.4.1 批量樣本測(cè)試和直擴(kuò)批量樣本測(cè)試

取400份Chelex-100法提取的建庫(kù)血樣，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和DNA分型檢測(cè)。取400份建庫(kù)血樣，打孔直徑1 mm，進(jìn)行直接PCR擴(kuò)增和DNA分型檢測(cè)。與Sino fi ler試劑盒、Identi fi ler-plus試劑盒和Y- fi ler試劑盒以及AGCU Y-24試劑盒進(jìn)行一致性和成功率比較。

1.4.2 靈敏度檢測(cè)

取9948 (男性DNA)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，分別以1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.031 ng的模板量，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和DNA分型檢測(cè)，每種濃度進(jìn)行兩次平行實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 混合樣本檢測(cè)

取9948 (男性DNA)和9947A (女性DNA)標(biāo)準(zhǔn)品，按兩者濃度比1：1，1：2，1：4，1：9，1：19的比例混合，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和DNA分型檢測(cè)，每種混合比濃度進(jìn)行兩次平行實(shí)驗(yàn)。

1.4.4 種屬特異性檢測(cè)

取購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的豬、牛、羊、雞、鴨、魚的血，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和DNA分型檢測(cè)。

1.4.5 案件生物檢材檢測(cè)

取日常刑事案件檢材 38份，其中血斑8份，煙蒂21份，肋軟骨5份，精斑4份，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和DNA分型檢測(cè)。

1.4.6 對(duì)不同種類和濃度抑制劑的耐受檢測(cè)

取分別含有不同濃度的血紅素、血紅蛋白、腐殖酸等抑制劑的模板DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和DNA分型檢測(cè)。

2 結(jié)果

400份血樣經(jīng)Chelex-100法提取后，PCR擴(kuò)增、檢測(cè)，結(jié)果穩(wěn)定，圖譜清晰完整（圖1），與Sino fi ler試劑盒、Identi fi ler-plus試劑盒和Y- fi ler試劑盒以及AGCU Y-24試劑盒中相對(duì)應(yīng)基因座的DNA分型結(jié)果完全一致，具有良好的準(zhǔn)確性和一致性。另400份血樣免提取、直接打孔擴(kuò)增后，檢測(cè)效果與Chelex-100法提取的相同（圖2，其中DYS527 a/b和DYS385 a/b基因座有兩個(gè)峰）。

DNA9948對(duì)照品，以濃度1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.031 ng的模板量擴(kuò)增，結(jié)果顯示：當(dāng)DNA模板濃度大于等于0.125 ng時(shí)，所有基因座均能明確分型（圖3、4），分型結(jié)果準(zhǔn)確、清晰；模板濃度為0.0625 ng時(shí)，有2個(gè)STR基因座和1個(gè)Y基因座未測(cè)出；模板濃度為0.0312 ng時(shí)，有8個(gè)STR基因座和3個(gè)Y基因座未顯示。

對(duì)照DNA9948與9947A的濃度比值大于等于1：4時(shí)，男性DNA的常染色體和Y染色體基因座均能明確分型（圖5）；但對(duì)照DNA9948與9947A的濃度比值小于1：4，比如1：9時(shí)，男性DNA部分基因座可檢出，當(dāng)1：19時(shí)，男性DNA基因座未檢出。

圖1 Chelex法提取的無(wú)關(guān)個(gè)體血樣檢測(cè)結(jié)果圖譜Fig.1 Exampled STR genotyping pro fi le of Chelex-extracted DNA from one of 400 unrelated individuals

圖2 直擴(kuò)法提取的無(wú)關(guān)個(gè)體血樣檢測(cè)結(jié)果圖譜Fig.2 Exampled STR genotyping pro fi le by direct ampli fi cation of one blood sample from another 400 unrelated individuals

圖3 模板DNA濃度分別為1.0、0.5、0.25、0.125ng的檢測(cè)結(jié)果Fig.3 STR genotyping pro fi les of the control DNA 9948 at the template concentrations of 1.0, 0.5, 0.25 and 0.125ng

圖4 模板DNA濃度為0.125ng的檢測(cè)結(jié)果Fig.4 STR genotyping pro fi le of the control DNA 9948 at the template concentration of 0.125ng

圖5 DNA9948與9947A的濃度比值大于等于1：4的混合DNA的檢測(cè)結(jié)果Fig.5 STR genotyping pro fi les from the mixture of DNA controls 9948 and 9947A at the ratios equal to or over 1:4

農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的豬、牛、羊、雞、鴨、魚血，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，在分析范圍內(nèi)，沒(méi)有檢出DNA分型。38份不同類型案件檢材用各自常規(guī)方法提取后，PCR擴(kuò)增、檢測(cè)，結(jié)果穩(wěn)定，圖譜清晰完整，與Sino fi ler試劑盒、Identi fi ler-plus試劑盒和Y- fi ler試劑盒以及AGCU Y-24試劑盒中相對(duì)應(yīng)基因座的DNA分型結(jié)果完全一致，具有良好的準(zhǔn)確性和一致性。當(dāng)模板DNA中含抑制劑血紅素濃度為100 μmol／L和150 μmol／L時(shí)，所有基因座均能明確分型；當(dāng)模板DNA中抑制劑血紅素濃度為200 μ mol／L時(shí)，所有基因座均未檢出；當(dāng)模板DNA中含抑制劑血紅蛋白濃度為500 μ mol／L時(shí)，所有基因座均能明確分型；當(dāng)模板DNA中抑制劑血紅蛋白濃度為750 μmol／L時(shí)，有2個(gè)STR基因座未檢出；當(dāng)模板DNA中抑制劑血紅蛋白濃度為1000 μ mol／L時(shí)，所有基因座均未檢出；當(dāng)模板DNA中含抑制劑腐殖酸濃度為5 ng／μ L和10 ng／μL時(shí)，所有基因座均能明確分型；當(dāng)模板DNA中抑制劑腐殖酸濃度為20ng／μL時(shí)，有2個(gè)STR基因座和1個(gè)Y基因座未檢出。

3 討論

我國(guó)的法庭科學(xué)DNA數(shù)據(jù)庫(kù)自建立以來(lái)已在公安實(shí)際檢案中發(fā)揮了巨大作用。由于罪犯男性居多，在DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中增加Y染色體的男性家系遺傳特性及其比對(duì)功能，將會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)展DNA數(shù)據(jù)庫(kù)的功效。同時(shí)，鑒于中國(guó)DNA數(shù)據(jù)庫(kù)的規(guī)模大，將常染色體STR和Y-STR的基因座納入一個(gè)試劑盒中，將能極大節(jié)約辦案經(jīng)費(fèi)，提升辦案效率[7]，有利于快速比對(duì)出犯罪嫌疑人，為偵查破案贏得時(shí)間。本檢測(cè)系統(tǒng)將15個(gè)常染色體和18個(gè)Y染色體的STR基因座以及性別基因座整合到一起復(fù)合擴(kuò)增，比董研報(bào)道[8]的體系多了8個(gè)Y染色體的STR基因座。其中，DYS385和DYS527因有回文結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)為兩個(gè)峰，有a/b之分，故它們均按兩個(gè)基因座計(jì)算，而這也與ladder相一致。常染色體和Y染色體同時(shí)檢測(cè)，省時(shí)、省力，又滿足了微量物證對(duì)DNA量無(wú)法兩次檢驗(yàn)的需求，一次性就能獲得盡可能多的遺傳信息。由于該體系含有34個(gè)基因座，故采用了六色熒光標(biāo)記，從而合理分布各等位基因座檢測(cè)范圍，避免造成等位基因座檢測(cè)范圍交叉重疊、等位基因丟失與錯(cuò)位等問(wèn)題的出現(xiàn)，有利于得到明確、清晰的分型（見圖 6）。

圖6 Ladder中各基因座的分型范圍Fig.6 Genotyping range of each genetic locus in the ladder

本試劑盒可采用直擴(kuò)技術(shù)，能有效縮短整個(gè)檢測(cè)過(guò)程時(shí)間，提高整體系統(tǒng)效能。對(duì)于直擴(kuò)的400份無(wú)關(guān)血樣，單層取樣，直徑1 mm。擴(kuò)增時(shí)采用20 μ l體系，加樣1.5 μl，檢測(cè)結(jié)果所有基因座峰高均高于2000，大部分峰高介于6000～8000，各樣品圖譜完整清晰。各樣品分型與Sino fi ler試劑盒、Identi fi ler-plus試劑盒與Y- fi ler試劑盒以及AGCU Y-24試劑盒在共有基因座上分型完全一致。直擴(kuò)技術(shù)減少了DNA提取步驟，既省時(shí)省力，又減少了污染環(huán)節(jié)[9]，在大規(guī)模建庫(kù)和快速排查嫌疑人的過(guò)程中優(yōu)勢(shì)明顯。

綜上所述，本文建立的15個(gè)常染色體和18個(gè)Y染色體的STR基因座以及性別基因座的復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)體系，其穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、靈敏度和法醫(yī)學(xué)適用性以及抗抑制性均達(dá)到了商品化試劑盒的檢測(cè)水平，為法庭科學(xué)實(shí)踐提供了更快速、便捷的新方法，在刑案?jìng)善啤⒎ㄍプC據(jù)、數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)以及親權(quán)鑒定方面應(yīng)都具有更大的應(yīng)用潛力。

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