吳長平，鐘芳芳，霍國昌，趙謀明，蘇國萬

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）（2.江門市江戶泉食品有限公司，廣東江門 529000）

鈣是人體不可或缺的重要元素，主要由日常飲食中攝入，如牛奶和奶制品。但如果人體鈣攝入不足，或肌醇六磷酸、纖維素、脂肪等其他成分降低鈣的溶解性影響吸收，會產(chǎn)生低鈣血癥和骨質(zhì)流失，增加骨質(zhì)疏松的風險。王惠君[1]跟蹤研究了我國九個省份居民近10年鈣攝入量情況，發(fā)現(xiàn)18～49歲成年男性和女性的日常鈣攝入量僅為推薦攝入量的50%左右。而兒童和嬰兒的鈣攝入量則更低。因此，我國居民補鈣刻不容緩，迫在眉睫。

目前市面上補鈣劑大概可分為三類[2]，第一類是無機鈣，鈣含量高，但吸收率低；第二大類是有機酸鈣，此類補鈣劑溶解性好，但大量被機體吸收后會誘發(fā)負反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，反而抑制鈣的吸收；第三類是近幾年興起的氨基酸螯合鈣，氨基酸和小肽能與金屬離子結(jié)合生成M-多肽/氨基酸的形式進入細胞，然后在細胞中主動分裂，釋放出Mn+便被細胞利用，從而促進金屬離子吸收[3,4]，是一種優(yōu)質(zhì)的補鈣劑。酪蛋白磷酸肽（CPP）是最早用來促進金屬離子吸收的多肽，但CPP相對較高的價格，以及乳糖不耐受癥不可避免的限制了其作為補鈣劑的普遍應(yīng)用。因此，其他蛋白來源如雞蛋黃卵黃高磷蛋白和魚蛋白和大豆蛋白等酶解產(chǎn)物作為新型鈣螯合肽是CPP理想的替代方案。

鰻魚，又稱日本鰻和白鱔等，味道鮮美，營養(yǎng)豐富。鰻魚肉、皮中含有豐富優(yōu)質(zhì)蛋白，蛋白含量甚至高于豬、牛、雞等餐桌上常見的肉類，且氨基酸均衡，其中人體生命活動必需的氨基酸占了將近40%[5]。

1980年，我國開始引進鰻魚養(yǎng)殖，目前我國已成為養(yǎng)殖鰻魚數(shù)量最多的國家，但以活鰻出口和鰻魚粗加工為主[6]。在粗加工過程中會產(chǎn)生大量的下腳料（鰻魚頭和尾等），其重量約占原料鰻魚本身重量40～55%，下腳料中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪和礦物質(zhì)等，如果不加以利用，將造成資源的極大浪費，增加環(huán)境壓力。

近年來，精深加工的鰻魚產(chǎn)品悄然豐富起來，如用鰻魚骨提取鈣，作為高級營養(yǎng)補鈣品的原料；以鰻魚為原料，生產(chǎn)有保健功能的口服液；利用廢棄的下腳料提取魚油等。雖然深加工產(chǎn)品越來越多樣化，但我國的水產(chǎn)品加工率仍然不容樂觀，不到發(fā)達國家的15%[6]。因此對鰻魚加工副產(chǎn)物-鰻魚尾進行精深加工，開發(fā)出具有多種功能的新產(chǎn)品，不僅可提高低值蛋白資源的利用率，提高附加值，還可拓展其應(yīng)用范圍，具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 原料

鰻魚尾：由江門市江戶泉食品有限公司提供；沖洗干凈放入絞肉機中絞成肉糜，置于-18 ℃冰箱中冷凍保存，備用。

酸性蛋白酶（酶活力4.57×104U/g，最適pH值4.0）、中性蛋白酶（酶活力8.82×104U/g，最適pH值7.0）、復(fù)合蛋白酶（酶活力1.86×105U/g，最適pH值7.0）、水解蛋白酶（酶活力1.75×105U/g，最適pH值8.0）、Alcalase 2.4 L（酶活力1.70×105U/g，最適pH值8.0）、堿性蛋白酶（酶活力5.68×104U/g，最適pH值8.0）均購于美國諾維信公司；木瓜蛋白酶（酶活力5.65×105U/g，最適pH值6.5）購于廣州華琪生物科技公司；胰酶（酶活力2.30×105U/g，最適pH值8.0）購于重慶市祥盛生物制藥有限公司，其余試劑均為分析純；去離子水為實驗室自制。

1.2 主要試驗儀器

KND-103F型蛋白質(zhì)測定儀，上海纖檢儀器廠；SHA-C水浴恒溫振蕩器，江蘇省金壇市農(nóng)儀器有限公司；AL204電子分析天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；GL-21M高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機廠；雷磁pH計，上海儀電科學(xué)儀器有限公司；LABCONCO凍干機，美國LABCONCO公司。

1.3 試驗流程

鰻魚尾制備鈣螯合肽的工藝流程如圖1所示。

圖1 鰻魚鈣螯合肽制備工藝流程Fig.1 The process of preparing calcium-chelating peptides from eel tail

流水清洗干凈鰻魚尾，放入絞肉機絞成肉糜后冷凍保藏備用。取一定量鰻魚肉糜于250 mL錐形瓶中，按1:1（m/m）加入去離子水，調(diào)整pH值為添加酶制劑的最適pH值，分別加入酸性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、水解蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、Alcalase 2.4L和胰酶混勻密封，置于55 ℃恒溫水浴搖床中震蕩反應(yīng)一定時間后，置于沸水中15 min滅酶，在8000 r/min，25 ℃下離心25 min，取上清液過200目絹布以分離凝固的油脂，抽濾除去懸浮的雜質(zhì)得到澄清的酶解液，冷凍干燥得鰻魚肽粉。將鰻魚肽粉復(fù)溶成一定濃度的肽液，調(diào)整pH值，按一定質(zhì)量比加入鈣離子（以無水氯化鈣的形式），震蕩混勻后，恒溫螯合，按1:9（V/V）加入無水乙醇，靜置沉淀3 h[7]后，8000 r/min，4 ℃下離心25 min，取下層沉淀物凍干得鰻魚鈣螯合肽粉。

1.4 分析測定

1.4.1 粗蛋白測定

凱氏定氮法測定GB 5009.5-85[8]。

1.4.2 游離氨態(tài)氮含量測定

采用甲醛電位滴定法[9]來測定酶解液中游離氨態(tài)氮含量，用80 g去離子水為空白對照，取6 g酶解液，補水至80 g，以0.1 mol/L NaOH標準溶液滴定至其pH 8.2，再加入10 mL甲醛溶液，繼續(xù)使用同濃度的NaOH溶液滴定至pH 9.2，此時，分別記錄空白和樣液pH從8.2滴至9.2所消耗的NaOH溶液的體積V0和Vi。水解產(chǎn)物中游離氨態(tài)氮的含量為：

進而計算其水解度[10]為：

式中，Vi、V0分別指樣液和空白加入甲醛后pH從8.2滴定至9.2所消耗的NaOH標準溶液的體積，mL；Mi指測定樣品中游離氨基酸時的取樣量，g；AN指樣品中的游離氨基酸態(tài)氮的含量，%；M1指鰻魚酶解液的總質(zhì)量，g；W2指鰻魚肉糜的氮含量，g/g；M2指所加入的鰻魚肉糜的質(zhì)量，g。

1.4.3 肽得率的測定[10]

取酶解液10 mL，按照1:1（V/V）加入15%的TCA溶液，渦旋混勻后靜置30 min，在8000 r/min，25 ℃的條件下離心10 min，分別測定TCA酸沉離心后上清液的總氮含量和氨基酸肽氮含量，則肽得率計算方法如下：1.4.4 鈣螯合能力測定

采用EDTA配位滴定法[11]分別測定螯合物以及空白（200 mL水）中鈣離子含量，鈣離子螯合能力（mg/g）計算如下：

式中，C指EDTA溶液濃度，mol/L；V指滴定螯合沉淀所消耗的EDTA標準溶液體積，L；Vo指滴定空白所消耗的EDTA標準溶液的體積，L；M指鈣的摩爾質(zhì)量，g/mol；m指沉淀中所含肽的質(zhì)量，g。

1.4.5 水解氨基酸組成的測定

采用A300氨基酸自動分析儀（Membra Pure，Bodenheim，Germany）進行水解氨基酸組成分析。取5 mL、6 M的鹽酸在110 ℃條件下消化樣品24 h，定容至50 mL，取2 mL溶液揮干后用稀釋液稀釋，溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后測定。氨基酸的含量用mmol/g表示。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每個實驗重復(fù)3次，結(jié)果采用“平均值±標準偏差”表示。采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，差異顯著性分析采用ANOVA，p<0.05為有顯著性。采用Excel以及Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解工藝對酶解效果的影響

2.1.1 蛋白酶種類對鰻魚尾酶解效果的影響

圖2為不同蛋白酶水解鰻魚尾的蛋白回收率、肽得率以及鈣螯合能力。由圖2可知，胰酶和Alcalase 2.4L的蛋白回收率及肽得率均高于其他酶制劑，堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶次之。酶解反應(yīng)具有特異性，每種酶制劑均具有特異酶切位點，即使是具有相似性質(zhì)的酶制劑，在酶切位點上都會有一定的偏好。Alcalase 2.4L蛋白酶是一種絲氨酸型內(nèi)切酶，酶切位點較多，因此肽得率和氮回收率都比較高；而胰酶的特異酶解位點包括由精氨酸的羧基組成的肽鏈，以及由賴氨酸、精氨酸、組氨酸等堿性氨基酸的羧基形成的肽鍵、酰胺鍵以及酯鍵[12]，鰻魚原料中的精氨酸、賴氨酸、組氨酸等堿性氨基酸的含量高達29.98%[4]，約占了總氨基酸含量的三分之一。因此，相對于Alcalase 2.4L蛋白酶以及其他酶制劑而言，胰酶對鰻魚原料具有更多的酶切位點，這也是胰酶水解產(chǎn)物回收率最高的原因之一。酸性蛋白酶水解產(chǎn)物的蛋白回收率以及肽得率均為最低，但鈣螯合能力遠遠超過其他蛋白酶，高達75 mg/g，而其他酶制劑酶解所得的鰻魚肽的鈣離子螯合能力均低于50 mg/g。

洪慧等[13]人用堿性蛋白酶水解鰈魚骨，獲得了高螯合率的魚骨膠原多肽螯合鈣，夏光華[14]等人為了制備膠原蛋白小肽螯合鈣，也預(yù)先用堿性蛋白酶和酸性蛋白酶對原料進行水解。多肽與金屬離子的螯合反應(yīng)復(fù)雜，多與多肽上所含的堿性或者是酸性基團相關(guān)，尤其是羧基和氨基[5]。本文中由酸性蛋白酶酶解所得的多肽與鈣離子的螯合活性最佳，推測原因為在酸性條件下，水解反應(yīng)釋放了更多的呈酸性的基團，如羧基和磷酸基團等，在之后的螯合反應(yīng)中對螯合活性有顯著影響。

考慮到與鈣離子螯合能力和肽得率等因素，將選用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、胰酶、Alcalase 2.4L蛋白酶分別和酸性蛋白酶進行復(fù)配，進一步研究，由于復(fù)配的兩種酶制劑的pH相差較遠，確定為分段酶解。

圖2 不同蛋白酶對鰻魚尾酶解效果的影響Fig.2 Effects of different proteases on the protein recovery,peptides yield and calcium chelating ability of eel tail

2.1.2 多種蛋白酶復(fù)配作用對鰻魚尾酶解效果的影響

圖3 多種蛋白酶的復(fù)配對鰻魚尾酶解效果的影響Fig.3 Effects of multiple proteases on the protein recovery,peptides yield and calcium chelating ability of eel tail

單酶酶解中，酸性蛋白酶的酶解產(chǎn)物鈣離子螯合活性最強，蛋白回收率和肽得率均為最低。圖3表明，與木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、胰酶以及Alcalase 2.4L復(fù)配使用后，酶解產(chǎn)物的蛋白回收率以及肽得率均有比較明顯的提高，但是鈣離子螯合活性有所下降。陳達等[16]人在酶解牡蠣蛋白制備鋅螯合物時，采用胃蛋白酶與胰蛋白酶復(fù)配酶解后，酶解產(chǎn)物的鋅離子螯合活性較胃蛋白酶單獨酶解也顯著降低。因此推測多肽的金屬離子螯合活性不僅與極性基團和氨基酸有關(guān)，而多肽的長度和結(jié)構(gòu)也產(chǎn)生一定的影響。相較于酸性蛋白酶單一酶解，其他酶的加入豐富了酶切位點，導(dǎo)致酶解產(chǎn)物中多肽長度和結(jié)構(gòu)變化，鈣離子螯合活性降低，但同時多肽的回收率也有所提升。其中酸性蛋白酶與胰酶復(fù)配后，鈣離子螯合活性無明顯下降，肽得率和蛋白質(zhì)回收率均顯著提升。因此綜合各個因素，最終選定所用胰酶與酸性蛋白酶為最優(yōu)復(fù)配酶解方案，由于酸性蛋白酶的蛋白回收率和肽得率都均較低，以及產(chǎn)物鈣離子螯合能力高的特性，決定先選用胰酶酶解，水解程度較大，之后再用酸性蛋白酶進行酶解，豐富酶切位點，得到鈣離子螯合能力強的鰻魚肽。

2.1.3 酶解時間對鰻魚尾酶解效果的影響

如圖4所示，隨著酸性蛋白酶反應(yīng)時間的繼續(xù)增加，酶解產(chǎn)物的肽得率、蛋白回收率和鈣螯合能力均有下降。分析試驗結(jié)果可得出，酸性蛋白酶對蛋白回收率以及肽得率的貢獻不大，并且隨著反應(yīng)不斷進行，多肽會發(fā)生聚集，從而降低蛋白回收率。試驗結(jié)果與前面的試驗相符，Nie R[16]在研究中也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。先用胰酶酶解，獲得較多的水溶性多肽之后，再用酸性蛋白酶酶解以得到鈣螯合能力較強的鰻魚肽，在預(yù)實驗的基礎(chǔ)之上，本文并未對胰酶的酶解時間進行優(yōu)化。因此胰酶酶解3 h后，調(diào)整pH值，再加入酸性蛋白酶酶解2 h為較優(yōu)的方案。

圖4 多酶解時間對鰻魚尾酶解效果的影響Fig.4 Effects of different enzymatic time on the protein recovery, peptides yield and calcium chelating ability of eel tail

2.1.4 加酶量對鰻魚尾酶解效果的影響

圖5 加酶量對鰻魚尾酶解效果的影響Fig.5 Effects of different enzyme dosages on the protein recovery, peptides yield and calcium chelating ability of eel tail

由圖5可知，各項指標隨著酶量的增加先上升后呈現(xiàn)下降趨勢，此實驗結(jié)果與汪婧瑜等[17]的研究一致。隨著酶添加量的不斷增加，各項指標均出現(xiàn)了下降的趨勢，這有可能是水解度增大，反應(yīng)體系中多肽的種類越來越多，小分子肽之間吸附以及其他作用導(dǎo)致部分多肽和氨基酸聚集之后，隨著分子量的增大，疏水基團增多而沉淀下來。酶添加量為7.5‰時，反應(yīng)得多肽的鈣離子螯合能力達到峰值，而肽得率和蛋白回收率均在酶添加量為10‰時達到峰值，再可綜合考慮到經(jīng)濟效益，最終選取酶添加量為7.5‰為最優(yōu)酶濃度。

2.2 螯合工藝對鈣螯合能力的影響

2.2.1 pH值對鈣螯合能力的影響

圖6 不同pH值對鈣螯合能力的影響Fig.6 Effects of different pH values on the calcium chelating ability of eel peptides

如圖6所示，隨著pH的增加，鈣離子螯合能力先增加，當pH達到9.0時，則開始下降，說明pH對螯合活性的影響較大。pH小于7時，反應(yīng)體系呈酸性，因此在反應(yīng)體系中存在著大量游離的H+會與同樣是帶正電的的Ca2+搶奪供電子基團，與Ca2+存在競爭供電子基團的關(guān)系，并與肽類上的供電子基團螯合，表現(xiàn)為肽螯合Ca2+的活性降低；當pH大于7時，體系中的H+開始被OH-取代，肽類上的供電子基團處于待螯合狀態(tài)，Ca2+能自由與其螯合，但是當pH繼續(xù)上升，體系中OH-含量越來越高，達到某以特定OH-含量時，OH-將于Ca2+螯合，將Ca2+沉淀下來，肽能螯合Ca2+的含量自然也就減少，此結(jié)果與夏光華[14]和范露[7]等人的研究結(jié)果相近，因此確定pH為9.0為最佳螯合pH。

2.2.2 質(zhì)量比對鈣螯合能力的影響

隨著反應(yīng)系統(tǒng)中肽所占比例的增加，每克肽所螯合的鈣的質(zhì)量稍有降低，相比于劉閃[18]等人以及高菲[19]等人的研究結(jié)果，略有不同，二者的研究結(jié)果均為肽鈣質(zhì)量比大于1。據(jù)研究，肽與金屬離子的反應(yīng)比較復(fù)雜，涉及到兩者間的配位、吸附等多種作用。近年來的研究結(jié)果表明，肽類上的顯酸性或者堿性的基團以及氨基酸對肽的金屬離子螯合活性貢獻最大。而鰻魚原料中堿性氨基酸的含量高達29.98%，酸性氨基酸含量8.87%[4]，說明由鰻魚酶解所得的鰻魚肽能提供足夠的螯合位點，在肽：鈣質(zhì)量比較低的情況下便能使螯合反應(yīng)飽和，因此肽鈣比1:2（g/g）為最優(yōu)質(zhì)量比。

圖7 質(zhì)量比對鈣螯合能力的影響Fig.7 Effects of different mass ratios on the calcium chelating ability of eel peptides

2.2.3 溫度對鈣螯合能力的影響

圖8 溫度對鈣螯合能力的影響Fig.8 Effects of different temperatures on the calcium chelating ability of eel peptides

隨著溫度的變化，鈣離子螯合能力比較穩(wěn)定，波動不大，說明溫度的變化對螯合活性的影響不大，與各學(xué)者的結(jié)果相近[13～18]。但是溫度的上升，鰻魚肽的鈣離子螯合能力稍有降低，這有可能是因為肽與鈣離子的螯合生成肽-M形式的產(chǎn)物時，有新的鍵生成，會放出一定的熱量，溫度高不利于正向反應(yīng)。也有可能是因為隨著溫度的上升，肽類結(jié)構(gòu)發(fā)生了一些變化，導(dǎo)致反應(yīng)活性位點的位置變得不易暴露，鈣離子與其的螯合更難。因此30 ℃為最佳螯合溫度。

2.3 鰻魚肽及其鈣螯合物的氨基酸組成分析

鰻魚肽中谷氨酸的含量最高（12.88 g/100 g），其次是甘氨酸（8.88 g/100 g）和天冬氨酸（8.77 g/100 g），而苯丙氨酸、半胱氨酸、組氨酸、蛋氨酸的含量比較少，這是典型的膠原蛋白肽的氨基酸組成[20]，說明鰻魚肽中膠原蛋白肽占主要地位。相較于鰻魚肽，鰻魚鈣螯合肽中谷氨酸和天冬氨酸的含量有一個大幅度的提升，分別為22.31 g/100 g，17.02 g/100 g，提高了73.21%和94.07%，說明在鰻魚肽與鈣的螯合反應(yīng)中，谷氨酸和天冬氨酸等酸性氨基酸的貢獻很大，可能是谷氨酸和天冬氨酸側(cè)鏈的羧基在與鈣的反應(yīng)中貢獻較大，這和前期酸性蛋白酶酶解產(chǎn)物鈣螯合能力最強的現(xiàn)象完全吻合。

表1 鰻魚肽及其螯合物的氨基酸組成Table 1 The amino acid composition of eel peptides and peptide-cacium chelate

3 結(jié)論

本文將鰻魚加工下腳料鰻魚尾在55 ℃，加酶量為7.5‰的條件下，用胰酶酶解3 h，酸性蛋白酶酶解2 h，蛋白回收率達到66.61%，肽得率為52.46%；凍干的鰻魚肽粉在30 ℃，pH 9.0，肽鈣比為1:2（g/g）條件下反應(yīng)30 min，得到含鈣量59.37 mg/g的鰻魚鈣螯合肽粉。在鰻魚肽與鈣的螯合反應(yīng)中，谷氨酸和天冬氨酸等酸性氨基酸的貢獻最大。本文優(yōu)化了鰻魚尾酶解工藝以及鰻魚鈣螯合肽粉的制備工藝，提升了鰻魚尾的利用價值，拓寬了鰻魚的產(chǎn)品領(lǐng)域，為鰻魚鈣螯合肽粉的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論和技術(shù)指導(dǎo)。

[1] 王惠君,張兵,王志宏,等.1991-2009年中國九省區(qū)膳食營養(yǎng)素攝入狀況及變化趨勢(四)50-79歲居民蛋白質(zhì)攝入狀況及變化趨勢[J].營養(yǎng)學(xué)報,2011,33(5):446-451

WANG Hui-jun, ZHANG Bing, WANG Zhi-hong, et al. The trend of nutrients intake of Chinese residents in nine provinces from 1991 to 2009(Ⅳ) the portein intake trend of chinese adults aged 50-79 years [J]. Journal of Nutrition,2011, 33(5): 446-451

[2] Goda T, Kishi K, Ezawa I, et al. The Maltitol-induced increase in intestinal calcium transport increases the calcium content and breaking force of femoral bone in weanling rats[J]. Journal of Nutrition, 1998, 128(11): 20-28

[3] Cousins R J. Regulation of zinc absorption: role of intracellular ligands. [J]. American Journal of Clinical Nutrition, 1979, 32(2): 339-345

[4] 劉兆鈞.鰻魚營養(yǎng)ABC[J].福建水產(chǎn),1999,4:85-90

LIU Zhao-jun. Eel Nutrition ABC [J]. Fujian Aquatic Products, 1999, 4: 85-90

[5] 趙輝,徐大倫,周星宇,等.新鮮海鰻營養(yǎng)成分及其風味物質(zhì)分析[J].食品科學(xué),2010,31(20):278-281

ZHAO Hui, XU Da-lun, ZHOU Xing-yu, et al. Analysis of nutritional and flavor compounds in fresh muraenesox cinereus muscle [J]. Food Science, 2010, 31(20): 278-281

[6] 李書民,譚洪新,孫生智.中國鰻魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展困局及紓困對策[J].中國漁業(yè)經(jīng)濟,2013,31(1):24-28

LI Shu-min, TAN Hong-xin, SUN Sheng-zhi. The dilemma of China's eel industry and the countermeasures [J]. China Fishery Economy, 2013, 31(1): 24-28

[7] 范露,劉茹,熊善柏.魚蛋白肽鈣的分級及肽與鈣的結(jié)合性能研究[J].食品研究與開發(fā),2015,2:6-9

FAN Lu, LIU Ru, XIONG Shan-bo. Studies on classification of fish protein peptides-calcium and combination between peptide and calcium [J]. Food Research and Development,2015, 2: 6-9

[8] YANG Hui-fen, LI Ming-yuan, SHEN Wen. Physical examination of food hygiene standards manual [M]. Beijing:Standards Press of China, 1998

[9] 劉紹.食品分析與檢驗[M].武漢:華中科技大學(xué)出版社,2011

LIU Shao. Food analysis and inspection [M]. Wuhan:Huazhong University of Science and Technology Press, 2011

[10] 顧敏,趙謀明,王茜,等.青養(yǎng)蛋白抗氧化肽的制備及其胃腸道消化性的研究[J].食品工業(yè)科技,2013,34(23):196-200

GU Min, ZHAO Mou-ming, WANG Qian, et al. Research of frog antioxidant peptide and the activity of gastrointestinal digestion [J]. Science & Technology of Food Industry, 2013,34(23): 196-200

[11] Hirokawa T, Nishimoto K, Yang J, et al. Isotachophoretic separation behavior of rare-earth EDTA chelates and analysis of minor rare-earth elements in an iron ore by bidirectional isotachophoresis-particle-induced X-ray emission [J]. Journal of Chromatography A, 2001, 919(2): 417-426

[12] 馬世昌.化學(xué)物質(zhì)辭典[M].西安:陜西科學(xué)技術(shù)出版社,1999 MA Shi-chang. Chemical Dictionary [M]. Xi’an: Shaanxi Science & Technology Press, 1999

[13] 洪惠,羅永康,呂元萌,等.酶法制備魚骨膠原多肽螯合鈣的研究[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2012,17(1):149-155

HONG Hui, LUO Yong-kang, LV Yuan-meng, et al.Enzymatic preparation of chelated calcium from fish bone collagen polypeptide [J]. Journal of China Agricultural University, 2012, 17(1): 149-155

[14] 夏光華,申鉉日,酒志強.羅非魚皮膠原蛋白小肽螯合鈣的制備、鑒定及抗氧化研究[J].食品科技,2013,6:242-246

XIA Guang-hua, SHEN Xuan- ri, JIU Zhi-qiang. Preparation,indentification and antioxidant activity of tilapia fish skin collagen polypeptide chelated calcium [J]. Food Science &Technology, 2013, 6: 242-246

[15] 陳達,霍敏晶,黃文芊,等.牡蠣蛋白酶解物螯合鋅的工藝優(yōu)化[J].農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)刊,2012,10:5-7

CHEN Da, HUO Min-jing, HUANG Wen-qian. Optimization of technology for zinc binding activities of oyster protein hydrolysates [J]. Journal of Agricultural Science and Technology, 2012, 10: 5-7

[16] Nie R, Liu Y, Liu Z. The calcium-binding activity of fish scale protein hydrolysates [J]. Journal of Agricultural Chemistry & Environment, 2014, 3(1): 11-15

[17] 汪婧瑜,劉學(xué)銘,張業(yè)輝,等.烏鱧酶水解物螯合鈣的制備及其結(jié)構(gòu)分析[J].食品工業(yè)科技,2016,37(8):206-211

WANG Jing-yu, LIU Xue-ming, ZHANG Ye-hui, et al.Preparation and structural analysis of enzymatic hydrolysate chelated calcium from Channa Argus [J]. Science &Technology of Food Industry, 2016, 37(8): 206-211

[18] 劉閃,劉良忠,李小娜,等.白鰱魚骨膠原多肽螯合鈣的工藝優(yōu)化[J].食品科學(xué),2014,35(10):76-81

LIU Shan, LIU Liang-zhong, LI Xiao-na, et al. Optimization of the preparation of calcium-chelating polypeptides from silver carp bone collagen [J]. Food Science, 2014, 35(10):76-81

[19] 高菲,王維有,魯軍,等.海洋魚骨膠原肽鈣螯合物的制備及紅外光譜表征[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2015,45(1):47-54

GAO Fei, WANG Wei-you, LU Jun, et al. Preparation and infrared spectrum identification for marine fish ossein peptide chelated calcium [J]. Periodical of Ocean University of China,2015, 45(1): 47-54 Inwoo B, Kiyoshi O, Asami Y, et al.Biochemical properties of acid-soluble collagens extracted from the skins of underutilised fishes [J]. Food Chemistry,2008, 108(1): 49-54