徐佳，皮莉，張玉，崔丹瑤，張翠英，肖冬光

（天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

綠色熒光蛋白（Gfp）是一類存在于水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白[1]。當(dāng)用395 nm的紫外線或475 nm的藍(lán)光激發(fā)，Gfp就可在508 nm處發(fā)射綠色熒光。由于其基因可以在異源組織中表達(dá)并產(chǎn)生熒光[2]，檢測時不需抗體、輔因子、酶底物等其它成分，不影響宿主細(xì)胞[3]，因而可以鑒定、跟蹤、分選表達(dá)Gfp的活細(xì)胞，Gfp近年來成為細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)中廣泛應(yīng)用的報告蛋白[4]。Gfp已廣泛應(yīng)用于報告蛋白、融合標(biāo)記、生物傳感器、pH檢測傳感器、蛋白間相互作用、胞內(nèi)各器官蛋白的傳遞等領(lǐng)域。而與其它常用的報告基因相比，Gfp具有性質(zhì)穩(wěn)定、無細(xì)胞毒性、靈敏性、檢測便捷等優(yōu)點(diǎn)[5]，在熒光顯微鏡下，可直接觀察到活細(xì)胞中的Gfp綠色熒光，因此可作為研究與之融合的其他蛋白表達(dá)的報告基因。

GFPS65T突變體（S65突變?yōu)門）熒光強(qiáng)度比野生型Gfp強(qiáng)5倍，進(jìn)一步進(jìn)行F64L突變得到37 ℃下高效成熟的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（Egfp），大大增強(qiáng)了該報告分子的靈敏度[6]，是目前應(yīng)用最廣泛的熒光蛋白之一。但Egfp一般都需強(qiáng)啟動子以驅(qū)動Gfp基因在細(xì)胞內(nèi)足量的表達(dá)[7]，多數(shù)生物具有微弱的自發(fā)熒光現(xiàn)象，并有類似的激發(fā)和發(fā)射波長，影響了某些Gfp的檢測[8]。

近年來，由一系列具有不同調(diào)控強(qiáng)度的突變啟動子構(gòu)成的啟動子文庫，被用于對目的基因的表達(dá)進(jìn)行精確調(diào)控。啟動子文庫是不同啟動子強(qiáng)度的集合體，在構(gòu)建時，可對天然啟動子序列進(jìn)行突變，再從中篩選出合適強(qiáng)度的多個突變啟動子。

構(gòu)建過程中，啟動子序列的突變方式多種多樣，如易錯PCR[9]，DNA shuffling[10]，定點(diǎn)突變和化學(xué)合成[11]等，已基本成為常規(guī)操作，只要對反應(yīng)條件稍作優(yōu)化，即可獲得包含足夠豐富的突變序列。

Alper[12]等人通過易錯PCR，引入Gfp基因，獲得了噬菌體啟動子活性196倍范圍內(nèi)的突變啟動子文庫，證明可通過易錯PCR獲得啟動子活性差別較大的突變體，實(shí)現(xiàn)了對基因的精細(xì)調(diào)控。秦秀林[14]等人建立了適用于畢赤酵母組成型表達(dá)文庫篩選的高通量方法，利用高通量方法篩選了300株整合了（PGAP突變序列-yEGFP）表達(dá)單元的重組菌，從中挑選出6株yEGFP表達(dá)水平在G/GHg 0.6～218%范圍內(nèi)的重組細(xì)胞（G01、G02、G03、G0、G6）。因此啟動子文庫構(gòu)建的難點(diǎn)不在于如何實(shí)現(xiàn)啟動子突變序列的多樣性，而在于建立一個高效、靈敏和可靠的高通量篩選方法[13]，能有效地篩選到強(qiáng)度改變的啟動子突變體。故本研究以篩選PGK突變子為目標(biāo)，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，建立可靠的高通量篩選系統(tǒng)，為構(gòu)建PGK啟動子文庫奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

工業(yè)釀酒酵母α5（釀酒酵母工業(yè)菌株AY15的α型單倍體）、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、PyEGFP3質(zhì)粒、PAXSK質(zhì)粒、pUC-PIAK質(zhì)粒，以上均由天津科技大學(xué)天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基和溶液

YEPD培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，pH自然，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。固體培養(yǎng)基需再添加2%瓊脂粉。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，NaCl 1%，pH自然，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。固體培養(yǎng)基需再添加2%瓊脂粉。

MD培養(yǎng)基：YNB 13.4 g/L，生物素0.4 mg/L，葡萄糖20 g/L，pH 6.0，115 ℃，0.1 MPa滅菌30 min。

SD培養(yǎng)基：YNB 0.67%，葡萄糖2%，pH 6.0，115 ℃，0.1 MPa滅菌30 min。

BMD培養(yǎng)基：1M K2HPO4（pH 6.0）100 mL/L，YNB 13.4 g/L，生物素0.4 mg/L，葡萄糖20 g/L，pH 6.0，115 ℃、0.1 MPa滅菌30 min。

BMDY培養(yǎng)基：1M K2HPO4（pH 6.0）100 mL/L，YNB 13.4 g/L，生物素0.4 mg/L，葡萄糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L。pH 6.0，115 ℃、0.1 MPa滅菌30 min。

BSM1培養(yǎng)基：(NH4)2SO47 g/L，CaSO40.46 g/L，K2SO49.1 g/L，MgSO4·7H2O 7.5 g/L，PTM1 12 mL/L，葡萄糖20 g/L。pH 6.0，115 ℃、0.1 MPa滅菌30 min。

微量元素PTM1：CuSO4·5H2O 6 g/L，KI 0.08 g/L，生物素0.2 g/L，MnSO4·H2O 3 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 65 g/L，ZnSO4·7H2O 20 g/L，CoCl2·6H2O 0.5 g/L，H3BO30.02 g/L。

PBS緩沖溶液：KH2PO40.27 g/L，Na2HPO41.42 g/L，NaCl 8 g/L，KCl 0.2 g/L。用去離子水定容至1 L，用HCl/NaOH調(diào)pH 7.4，4 ℃冰箱保存。

1 mol/L醋酸鋰溶液：準(zhǔn)確稱取6.6 g醋酸鋰溶于80 mL蒸餾水中，并定容至100 mL，過膜除菌或121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，4 ℃冰箱保存。

1.1.3 酶與化學(xué)試劑

酵母基因組提取試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自Solarbio公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Pfu DNA聚合酶和DNTP購自寶生物工程（大連）有限公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒（Cycle Pure Kit）購自O(shè)mega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

M200PRO型光柵型多功能酶標(biāo)儀：瑞士帝肯有限公司；BX53F型熒光顯微鏡：日本OLYMPUS會社；島津紫外分光光度計UVmini-1240：島津儀器（蘇州）有限公司；F0199型48孔細(xì)胞培養(yǎng)板：美國Coring公司；F0199型96孔酶標(biāo)板：美國Coring公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計與合成

本實(shí)驗所用引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，酶切位點(diǎn)以下劃線標(biāo)注。

表1 本實(shí)驗所用引物Table 1 Primers used in the current study

1.3.2 pUC-PEBBK質(zhì)粒的構(gòu)建

圖1 重組質(zhì)粒pUC-PEBBK構(gòu)建流程圖Fig.1 Construction flowchart of recombinant plasmid pUC-PEBBK

質(zhì)粒構(gòu)建流程圖如圖1所示。以PyEgfp3質(zhì)粒為模板，分別以EGFP-U2/EGFP-D1和EGFP-U1/EGFP-D2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到EGFP基因片段，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min；56 ℃ 1 min；72 ℃ 2 min；循環(huán)30次，72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物按照PCR產(chǎn)物回收試劑盒說明書的要求進(jìn)行純化回收。以實(shí)驗室保存的PAXSK質(zhì)粒為模板，分別以PA-U1/PA-D2和PA-U1/PA-D2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PGKt-KanMX-BATx-pUC-BATs基因片段，純化回收連接，得到pUC-PtEBBK質(zhì)粒。以實(shí)驗室保存的pUC-PIAK質(zhì)粒為模板，以PGKp-U和PGKp-D為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PGKp基因片段，將PtEBBK質(zhì)粒用SacII和BssHII酶切線性并去磷酸化，與同樣經(jīng)過SacII和BssHII酶切的PGKp基因片段連接，得到pUC-PEBBK質(zhì)粒。

1.3.3 突變菌株α5-PEBBK的構(gòu)建

酵母以質(zhì)粒pUC-PEBBK為模板，BATs-U和BATx-D為引物PCR擴(kuò)增基因片段。將純化后的重組片段BATs-PGKp-Egfp-PGKt-KanMX-BATx，經(jīng)醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法[15]將其導(dǎo)入到釀酒酵母單倍體α5中，并使重組菌株產(chǎn)生G418抗性，使用含G418 YEPD平板進(jìn)行篩選。

1.3.4 熒光顯微鏡檢測

將重組菌株α5-PEBBK用YEPD培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，將菌液離心，收集菌體，用PBS（pH 7.0）稀釋至OD600=1，取一滴制成玻片，使用熒光顯微鏡檢測細(xì)胞Egfp熒光強(qiáng)度，通過熒光顯微鏡觀察。

1.3.5 酶標(biāo)儀檢測

重組菌株α5-PEBBK 和親本菌株α5經(jīng)YPD培養(yǎng)后，菌體收集用PBS洗一次，用PBS（pH 7.0）稀釋至OD600=1，經(jīng)PBS重懸后將稀釋后樣品取250 μL至96孔板，使用熒光酶標(biāo)儀檢測Egfp熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長510 nm），并檢測OD600，檢測Egfp熒光強(qiáng)度時，以不表達(dá)Egfp的基因工程菌α5作為對照去除背景干擾，比熒光強(qiáng)度（RFU/OD600）為熒光強(qiáng)度值比上對應(yīng)細(xì)胞密度。

1.3.6 培養(yǎng)基對重組菌生長的影響

分別用SD、MD、BMD、BSM1培養(yǎng)基培養(yǎng)重組菌α5-PEBBK和親本菌株α5，各作三個平行，經(jīng)30 ℃，200 r/min，試管培養(yǎng)36 h，測定細(xì)胞密度OD600。

1.3.7 培養(yǎng)基對Egfp表達(dá)的影響分別用SD、MD、BMD、BSM1培養(yǎng)基培養(yǎng)重組菌α5-PEBBK和親本菌株α5，經(jīng)30 ℃，200 r/min，試管培養(yǎng)36 h，經(jīng)熒光酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度RFU，根據(jù)1.3.6測得的細(xì)胞密度OD600，計算比熒光強(qiáng)度

RFU/OD600。

1.3.8 48孔板接種量的優(yōu)化

在確定了合適的培養(yǎng)基后，利用48孔深孔板，對不同階段的接種量和培養(yǎng)時間進(jìn)行優(yōu)化，每孔裝900 μL BSM1，分別取10 μL、20 μL、30 μL、40 μL經(jīng)過24 h培養(yǎng)的種子液，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)60 h，每間隔12 h取樣測細(xì)胞密度OD600。

1.3.9 最佳檢測熒光強(qiáng)度時間的確定

用BSM1培養(yǎng)基培養(yǎng)重組菌α5-PEBBK和親本菌株α5，各接種40 μL種子液，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)60 h，每間隔12 h取樣測OD600和RFU，計算比熒光強(qiáng)度RFU/OD600。

2 結(jié)果與討論

2.1 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白Egfp在釀酒酵母中的表達(dá)

圖2 重組質(zhì)粒pUC-PEBBK驗證Fig.2 The confirmation of the recombinant plasmid pUC-PEBBK

2.1.1 pUC-PEBBK質(zhì)粒的驗證和BssHII雙酶切后。（c）M：DL5000 DNA Marker；1：BATs-U和EGFP-D為引物PCR驗證。

按照1.3.2方法獲得重組質(zhì)粒，提取質(zhì)粒pUC-PEBBK，將重組質(zhì)粒pUC-PEBBK分別用SacII和BssHII單酶切，酶切后得到7785 bp的單一條帶，如圖2a。分步用SacII和BssHII雙酶切后得到6300 bp和1481 bp的條帶（圖2b），證明連接正確。并用引物PGKp-U和EGFP-D PCR驗證，得到2300 bp大小正確條帶，結(jié)果如圖2c。

2.1.2 重組菌株α5-PEBBK的驗證

圖3 α5-PEBBK上下游定點(diǎn)驗證Fig.3 The PCR verification of the mutant strain α5-PEBBK

將轉(zhuǎn)化子提取基因組DNA，然后PCR定點(diǎn)驗證，結(jié)果如圖3所示。以重組菌株基因組DNA為模板，親本菌株α5基因組DNA為陰性對照，分別以B1-U和PGKp-D，PGKp-U和B2-D兩對引物進(jìn)行上下游定點(diǎn)驗證，陰性對照α5親本菌株由于不含有Egfp基因及其與PGK啟動子相連序列，無法擴(kuò)增出目的條帶，重組菌株則可以擴(kuò)增出2456 bp和4028 bp大小條帶。由圖可知，PCR目的條帶單一，大小正確，證明BAT2基因已經(jīng)敲除，基因整合成功，得到正確的重組菌株α5-PEBBK。

2.1.3 熒光顯微鏡檢測Egfp熒光

圖4 熒光顯微鏡檢測重組菌株α5-PEBBK Egfp熒光強(qiáng)度Fig.4 Fluorescence of Egfp measured by the fluorescence microscope in α5-PEBBK strain

使用熒光顯微鏡檢測重組細(xì)胞Egfp熒光強(qiáng)度，在重組菌細(xì)胞內(nèi)觀察到Egfp表達(dá)所產(chǎn)生的熒光（圖4），結(jié)果證明啟動子PGK可調(diào)控綠色熒光蛋白Egfp在酵母中的表達(dá)。

2.1.4 多功能酶標(biāo)儀檢測Egfp熒光強(qiáng)度

圖5 酶標(biāo)儀檢測重組菌株α5-PEBBK與親本菌株α5Egfp熒光強(qiáng)度Fig.5 Fluorescence of Egfp measured by the fluorescence microplate in α5-PEBBK and α5 strains

利用多功能酶標(biāo)儀檢測重組細(xì)胞Egfp熒光強(qiáng)度，如圖5所示，α5-PEBBK和α5的比熒光強(qiáng)度值分別為523和53，α5-PEBBK的比熒光強(qiáng)度是親本菌株α5的10倍。

2.2 PGK啟動子文庫高通量篩選方法的建立

2.2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1.1 培養(yǎng)基對Egfp熒光檢測的干擾

圖6 熒光酶標(biāo)儀測定無菌培養(yǎng)基熒光強(qiáng)度Fig.6 The fluorescence of the aseptic medium measured by fluorescence microplate

為了排除培養(yǎng)基成分對熒光檢測的干擾，以PBS為陰性對照，考察不同培養(yǎng)基對Egfp熒光檢測的影響，結(jié)果如圖6。

BSM1培養(yǎng)基的本底熒光強(qiáng)度值最?。?1 RFU），與PBS（54 RFU）接近，其次是SD（2100 RFU），MD（2910 RFU），BMD（2531 RFU），無菌培養(yǎng)基BMDY和YPD經(jīng)熒光酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，分別為：7971 RFU和8717 RFU，與PBS相比，高出近150倍。

圖7 熒光酶標(biāo)儀測定酵母浸粉（Yeast Extract）和蛋白胨（Tryptone）熒光強(qiáng)度Fig.7 The fluorescence of yeast extract and tryptone measured by fluorescence microplate

在本實(shí)驗中，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基成分對Egfp的檢測也有干擾，通過比較分析這幾個培養(yǎng)基成份，干擾Egfp的熒光檢測可能的物質(zhì)：培養(yǎng)基BMDY和YPD中含有酵母浸粉（Yeast Extract）和蛋白胨（Tryptone），通過熒光酶標(biāo)儀檢測，2% Yeast Extract和1% Tryptone溶液的熒光強(qiáng)度分別為3800 RFU和5400 RFU（圖7），證明含有酵母浸粉和蛋白胨的培養(yǎng)基均不適合檢測熒光菌株的培養(yǎng)。

2.2.1.2 培養(yǎng)基對重組菌生長的影響

圖8 不同培養(yǎng)基對重組菌生長的影響Fig.8 The effects of medium on the recombinant straingrowth

鑒于BSM1、SD、MD和BMD培養(yǎng)基對Egfp熒光強(qiáng)度測定干擾較小，可作為篩選用的培養(yǎng)基，又進(jìn)一步考查了它們對重組菌生長影響（圖8）。

結(jié)果表明，重組菌α5-PEBBK和親本菌株α5在同一種培養(yǎng)基上的生長速度沒有明顯差異，相比BMD、SD、MD三種培養(yǎng)基，BSM1更有利于兩株菌生長，兩種菌的細(xì)胞密度OD600均超過它們在BMD、SD、MD中的細(xì)胞密度。

2.2.1.3 培養(yǎng)基對重組菌Egfp表達(dá)影響

圖9 不同培養(yǎng)基對重組菌Egfp表達(dá)影響Fig.9 The effects of medium on the Egfp expression

結(jié)果表明，重組菌α5-PEBBK經(jīng)SD、MD、BMD培養(yǎng)基培養(yǎng)后，Egfp比熒光強(qiáng)度與親本菌株相差不大，而在BMS1中培養(yǎng)，重組菌株比熒光強(qiáng)度為937，是親本菌株比熒光強(qiáng)度的10倍（圖9）。綜上所述，在重組細(xì)胞α5-PEBBK中，基因Egfp在啟動子PGK的調(diào)控下獲得了正確的表達(dá)，但由于僅有1個拷貝基因整合在重組菌的染色體中，通過利用熒光酶標(biāo)儀檢測不同培養(yǎng)基對Egfp熒光表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)在YPD、BMDY、麥芽汁培養(yǎng)基中Egfp表達(dá)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度受到較強(qiáng)干擾，在SD、MD、BMD培養(yǎng)基中生長緩慢，在BSM1培養(yǎng)基中受到干擾較弱，便于檢測，比熒光強(qiáng)度重組菌和親本菌株相差較大，且較利于其生長，因此選定BSM1培養(yǎng)基為篩選培養(yǎng)基。

2.2.2 篩選條件的優(yōu)化

2.2.2.1 接種量的確定

圖10 培養(yǎng)板中不同接種量對重組菌和對照菌生長影響Fig.10 The effects of inoculum volume on the strains growth of α5-2 and α5 in the plate

由圖10可以看出，即使初始接種量不同，但重組菌α5-PEBBK和原菌α5生長曲線趨勢保持一致，培養(yǎng)板接種量對最終細(xì)胞密度無明顯影響，接種量為10 μL、20 μL、30 μL、40 μL時，重組菌在培養(yǎng)36 h 后，都從對數(shù)生長期過渡至穩(wěn)定期，培養(yǎng)板培養(yǎng)時間36 h細(xì)胞密度最大，達(dá)到平穩(wěn)期。但考慮到較大的接種量可降低操作實(shí)驗誤差，因此，確定預(yù)培養(yǎng)板的接種量為40 μL。

2.2.2.2 最佳檢測熒光強(qiáng)度時間的確定

圖11 重組菌熒光強(qiáng)度與時間的關(guān)系Fig.11 The correlation between fluorescence and time of recombinant bacteria

圖12 重組菌不同培養(yǎng)時間的比熒光強(qiáng)度Fig. 12 Specific fluorescence of recombinant strains at different time points

培養(yǎng)36 h重組菌與親本菌株熒光強(qiáng)度差異最大，如圖11，對重組菌α5-PEBBK而言，隨著時間的增加，熒光強(qiáng)度也線性增加，當(dāng)培養(yǎng)36 h以后，熒光強(qiáng)度的增長變緩；而隨著時間的增加，親本菌株α5的熒光強(qiáng)度始終恒定在一較低水平，實(shí)驗結(jié)果說明在36 h，α5-PEBBK與親本菌株α5熒光強(qiáng)度差異最大。通過考察不同時間點(diǎn)重組菌的比熒光強(qiáng)度，如圖12，可以發(fā)現(xiàn)，36～60 h重組菌比熒光強(qiáng)度維持在一恒定水平，因此，確定培養(yǎng)板培養(yǎng)36 h后測定重組菌Egfp熒光強(qiáng)度。

3 結(jié)論

3.1 在本研究中，我們以pUC19為載體，磷酸甘油酸激酶基因PGK啟動子為上游調(diào)控元件，KanMX抗性基因為篩選標(biāo)記，構(gòu)建酵母表達(dá)質(zhì)粒pUC-PEBBK，將綠色熒光蛋白Egfp整合到釀酒酵母基因組上，在啟動子調(diào)控下表達(dá)，同時敲除BAT2基因，獲得重組菌株α5-PEBBK，為篩選突變啟動子作為親本菌株，通過熒光顯微鏡可以清晰的看到Egfp基因在酵母細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。熒光分光光度計測得其激發(fā)波長488 nm，吸收波長510 nm，熒光酶標(biāo)儀檢測重組菌α5-PEBBK熒光強(qiáng)度是親本菌株α5的10倍。Egfp能夠在啟動子PGK調(diào)控下在釀酒酵母中表達(dá)。

3.2 利用48深孔板結(jié)合熒光酶標(biāo)儀檢測，建立了啟動子文庫的高通量篩選方法，通過培養(yǎng)基優(yōu)化，排除了YPD、BMDY、麥芽汁培養(yǎng)基中蛋白胨和酵母浸粉對綠色熒光蛋白檢測的干擾，實(shí)驗結(jié)果顯示在SD、MD、BMD中釀酒酵母生長緩慢，最終確定了利于Egfp表達(dá)和快速檢測的篩選培養(yǎng)基BSM1，最佳48孔板培養(yǎng)條件為接種量40 μL，培養(yǎng)時間為36 h。研究結(jié)果為實(shí)現(xiàn)48孔板高效、靈敏、可靠地篩選到強(qiáng)度微量改變的啟動子突變體奠定基礎(chǔ)。

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