高正君，謝沛霖，司小強，楊國虎，薛曉東，徐靖宏

(1.甘肅省人民醫(yī)院整形美容科 甘肅 蘭州 730000；2.浙江大學附屬第一醫(yī)院整形美容科 浙江 杭州 310003)

黑色素瘤（Melanoma，M）是起源于神經(jīng)嵴的黑素細胞惡性腫瘤，惡性度極高。若早期發(fā)現(xiàn)可能通過手術治愈，但進展期和發(fā)生遠處轉移者5年生存率不足5%，平均生存期僅2～8個月[1]。美國國立衛(wèi)生研究院（簡稱NIH）研究表明，黑色素瘤在世界各地的發(fā)病率迅速上升。據(jù)統(tǒng)計，黑色素瘤中，只有約13%～30%為色素痣來源，其余均為非色素痣來源[2]，而對黑色素瘤相關基因研究發(fā)現(xiàn)，BRAF基因是黑色素瘤中突變率最高的基因，是黑色素瘤特異性靶向治療的熱點基因，90%以上是BRAF V600E位點突變[3]，國內目前關于色素痣來源和非色素痣來源的黑色素瘤中BRAF V600E基因突變率的研究尚屬空白。本研究通過對不同來源黑色素瘤中BRAF V600E基因突變進行檢測，以探討B(tài)RAF基因突變與不同來源黑色素瘤的臨床表型關系。

1 材料和方法

1.1 材料：選取2010年1月1日-2016年12月31日于本院皮膚科和整形外科收治的84例黑色素瘤患者為研究對象，采集新鮮標本或病灶石蠟組織，所有標本均經(jīng)病理HE染色和免疫組化診斷證實，見圖1。所有患者均自愿參與本研究，并簽署知情同意書。

圖1 黑色素瘤標本病理檢測結果

1.2 臨床特征

1.2.1 非色素痣來源：共62例標本，男35例，女27例；漢族57例，回族3例，藏族2例；發(fā)病年齡26～90歲，平均57.2歲；發(fā)病部位：肢端33例，非肢端24例，黏膜5例；淋巴結轉移（-）36例，淋巴結轉移（+）26例，其中遠處轉移6例。

1.2.2 色素痣來源：共22例標本，男12例，女10例；漢族21例，回族1例，藏族0例；發(fā)病年齡29～88歲，平均57.5歲；先天性小痣9例，后天痣13例；發(fā)病部位：肢端12例，非肢端7例，黏膜3例；淋巴結轉移（-）13例，淋巴結轉移（+）9例，其中遠處轉移1例。

1.3 BRAF V600基因突變檢測方法

1.3.1 腫瘤基因組DNA提取方法：新鮮樣本使用Qiagen公司QIAamP DNA Mini試劑盒提取DNA，石蠟組織使用Qiagen公司的QIAamP DNA FFPE Tissue試劑盒提取DNA，提取后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴增目標片段：特異引物PCR擴增BRAF V600E基因外顯子15，引物參照相關文獻[3]報道。引物序列：15F：5’-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3’，15R:5’-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3’擴增后目標片段長度362bP。PCR反應體系：總體積為40μl，其中BRAF PCR反應液37μl，BRF酶系3μl。往上述PCR反應管中分別加入提取后的待測樣本核酸、BRAF陰性質控品、BRAF野生型陽性質控品、BRAF突變型陽性質控品10μl，按下列條件擴增：50℃ 2min，95℃ 15min預變性，然后按（94℃30s→55℃ 30s→72℃ 45s）×40個循環(huán)擴增，最后72℃延伸7min。

1.3.3 PCR產(chǎn)物檢測并純化：為證實PCR產(chǎn)物中有無目標DNA片段，取5μl PCR產(chǎn)物做1%～2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否有目的條帶擴增（目的條帶大小為362bP），如觀察到明顯的單一目的條帶，則將上述PCR產(chǎn)物及時進行純化，具體操作詳見PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明書。

1.3.4 基因分析儀測序分析：變性后的測序產(chǎn)物按加樣順序編輯樣品列表。使用ABI基因分析儀，應用ABI公司Data Collection與Sequencing Analysis軟件進行數(shù)據(jù)收集和分析。運行SeqScanner程序，導入測序結果。找出序列“TAGGTGATTT”。突變分析：序列“TAGGTGATTT”后的第14～16位堿基為600位點，觀察突變位點為單峰或雙峰。

1.4 統(tǒng)計學分析：所有數(shù)據(jù)應用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，四格表資料行χ2檢驗，或行×列表資料的χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BRAF V600E基因突變檢測結果：V600E未發(fā)生突變時，序列為GTG野生型，突變位點為單峰（見圖2A）；發(fā)生V600E突變時，為GWG，W表示T/A堿基雜合，突變位點

圖2 BRAF基因突變檢測結果

2.2 BRAF V600E基因突變與臨床表型的關系：由表1可知，非色素痣來源黑色素瘤突變率為45.2%；先天性小痣來源黑色素瘤突變率為11.1%；后天痣來源黑色素瘤突變率為15.4%，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.972，P＜0.05）。非色素痣來源黑色素瘤男性、女性突變率分別為28.6%、18.5%，色素痣來源黑色素瘤男性、女性突變率分別為41.7%、30.0%，組間比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2=2.358，P＞0.05）。非色素痣來源不同發(fā)病部位，肢端、非肢端及黏膜部位，突變率分別為27.3%、29.2%、40.0%，色素痣來源突變率分別為33.3%、28.6%、33.3%，組間比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.449，P＞0.05）。

表1 BRAF V600E基因突變率與臨床表型關系 （例）

3 討論

BRAF基因是位于染色體7q34的一種原癌基因。編碼一種絲/蘇氨酸特異性激酶，在絲裂原活化蛋白激酶（Mitogenactivated Protein Kinase，MAPK）途徑中起著關鍵作用，通過參與活化細胞表面黑素皮質激素受體，從而參與黑素細胞的增殖分化過程。許多惡性腫瘤中均存在不同比例的BRAF基因突變，黑色素瘤中已知的V600突變有V600E，V600K，V600R,其中V600E位點突變較多[3]。據(jù)報道，BRAF基因突變在30%～60%的黑色素瘤中及50%的交界痣中可被觀察到[4]，與國外報道相比，我國黑色素瘤BRAF基因突變率偏低，約為24.3%[5]。中國黑色素瘤的發(fā)病和遺傳學特點跟歐美完全不同，歐美黑色素瘤多發(fā)生于面部和體表皮膚，誘因主要是陽光暴曬，紫外線接觸過多[6-7]，而亞洲的黑色素瘤多發(fā)生于不接觸陽光的部位，發(fā)病與基因突變關系更加密切[5]。

BRAF基因突變導致惡性黑色素瘤發(fā)生機制尚不清楚，研究發(fā)現(xiàn)，突變BRAF基因產(chǎn)物的過表達可增加下游ERK（細胞外調節(jié)蛋白激酶，Extracellular Regulated Protein Kinases，ERK）的活性，減少T細胞識別的黑素瘤抗原（Melan-A/MART-1）、糖蛋白100（gp100）等的表達，造成免疫治療障礙。另有文獻報道[8-10]，MAPK通路聯(lián)同STAT3(信號傳導與轉錄激活因子通路,Signal Transducer and Activator of Transcription,STAT)可以使黑色素瘤細胞產(chǎn)生多種免疫抑制因子，從而導致免疫逃逸。

在黑色素瘤藥物治療方面，大劑量α-2b干擾素作為黑色素瘤輔助治療用藥已經(jīng)近半個世紀[11]，分子靶向治療近年來發(fā)展迅速，BRAF抑制劑（如vemurafenib維羅非尼、dabrafenib達拉非尼）首先取得突破，隨后BRAF抑制劑聯(lián)合MEK(絲裂原活化的細胞外信號調節(jié)激酶,Mitogen-activated Extracellular Signal-regulated Kinase,MEK) 抑制劑、PD-1單抗（程序性細胞死亡蛋白-1，Programmed Death-1，PD-1）使得有效率再次提高[12-14]。最近，除BRAF抑制劑外，免疫靶向治療[15-16]、溶瘤病毒瘤體內注射等[17]，也成為治療黑色素瘤的新方向。

色素痣在黑色素瘤的發(fā)生中占有重要地位，色素痣惡變?yōu)楹谏亓龅陌俜直雀骷覉蟮啦町惿醮螅赡芘c病史回顧不清或如何正確判斷是否源于色素痣有關。有資料顯示，先天性巨痣的惡變率約6%，由于先天性巨痣發(fā)生率低，在黑色素瘤中所占比例不大，本研究也無此類病例。

有文章報道BRAF基因突變率與發(fā)病部位有相關性，本次研究中將色素痣來源或非色素痣來源的黑色素瘤根據(jù)不同來源及發(fā)病部位分成了6組，BRAF基因突變率為27.3%～40.0%，但經(jīng)統(tǒng)計學處理后，差異無統(tǒng)計學意義。而非色素痣來源、先天性小痣來源、后天痣來源的黑色素瘤中BRAF基因突變率分別為45.2%、11.1%、15.4%，組間比較差異有統(tǒng)計學意義，且非色素痣來源黑色素瘤BRAF基因突變率近50%，說明BRAF基因突變在非色素痣來源黑色素瘤中多見，應引起重視。但本次研究中樣本量較少，仍需進一步充實樣本量，以明確不同來源黑色素瘤BRAF基因突變率是否存在差異。

[1]Tas F,Erturk K.Anemia in Cutaneous Malignant Melanoma:Low Blood Hemoglobin Level is Associated with Nodal Involvement, Metastatic Disease, and Worse Survival[J]. Nutr Cancer,2017,21:1-5.

[2]王煒.整形外科學[M].杭州:浙江科學技術出版社,2008:474-77.

[3]Helen Davies,Graham R,Bignell,et al.Mutations of the BRAF gene in human cancer[J].Nature,2002,417(6892):949-954.

[4]Moran B,Silva R,Perry AS,et al.Epigenetics of malignant melanoma[J].Semin Cancer Biol,2017.

[5]Wu X,Yan J,Dai J,et al.Mutations in BRAF codons 594 and 596 predict good prognosis in melanoma[J].Oncol Lett,2017,14(3):3601-3605.

[6]Fajuyigbe D,Young AR.The impact of skin colour on human photobiological responses[J].Pigment Cell Melanoma Res,2016,29(6):607-618.

[7]Slominski AT,Bro?yna AA,Zmijewski MA,et al.Vitamin D signaling and melanoma: role of vitamin D and its receptors in melanoma progression and management[J].Lab Invest,2017,97(6):706-724.

[8]Yinghui Li,Hui Shan Cheng,Wee Joo Chng,et al.Activation of mutant TERT promoter by RAS-ERK signaling is a key step in malignant progression of BRAF-mutant human melanomas[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2016,113(50):14402-14407.

[9]Tomei S,Bedognetti D,De Giorgi V,et al.The immune-related role of BRAF in melanoma[J].Mol Oncol,2015,9(1):93-104.

[10]Fischer GM,Vashisht Gopal YN,McQuade JL,et al.Metabolic strategies of melanoma cells: Mechanisms, interactions with the tumor microenvironment, and therapeutic implications[J].Pigment Cell Melanoma Res,2018,31(1):11-30.

[11]Di Franco S,Turdo A,Todaro M,et al.Role of Type I and II Interferons in Colorectal Cancer and Melanoma[J].Front Immunol,2017,8:878.

[12]Ribas A,Gonzalez R,Pavlick A,et al.Combination of vemurafenib and cobimetinib in patients with advanced BRAF-mutated melanoma: a phase 1b study[J].Lancet Oncol,2014,15(9):954-965.

[13]Merope Griffi n,Daniele Scotto,Debra H.Josephs,et al.BRAF inhibitors:resistance and the promise of combination treatments for melanoma[J].Oncotarget,2017,8(44):78174-78192.

[14]Hao C,Tian J,Liu H,et al.Efficacy and safety of anti-PD-1 and anti-PD-1 combined with anti-CTLA-4 immunotherapy to advanced melanoma: A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials[J].Medicine,2017,96(26):e7325.

[15]Valpione S,Campana LG.Immunotherapy for advanced melanoma:future directions[J].Immunotherapy,2016,8(2):199-209.

[16]Hassan Sadozai,Thomas Gruber,Robert Emil Hunger,et al.Recent Successes and Future Directions in Immunotherapy of Cutaneous Melanoma[J].Front Immunol,2017,8:1617.

[17]Tiantian Zhang,Yogesh R Suryawanshi,Helene M Woyczesczyk,et al.Targeting Melanoma with Cancer-Killing Viruses[J].Open Virol J,2017,11:28-47.