周艷麗，陳世杰，勞文艷,3，朱楊雄，趙曉紅,3,*

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一類多見于中老年人的以關(guān)節(jié)軟骨慢性退變?yōu)橹鳌④浌窍鹿歉淖兒突ぢ匝装Y為特征的關(guān)節(jié)疾病。隨著老齡化社會的到來，OA已成為導(dǎo)致老年人功能障礙，影響老年人生活質(zhì)量的常見疾病之一，因此對它的發(fā)病機(jī)制和有效預(yù)防措施的研究，已成為重要的公共衛(wèi)生課題。

OA是一種由多種因素共同作用而導(dǎo)致的疾病。其發(fā)生機(jī)理與衰老、創(chuàng)傷、過度勞損、肥胖、遺傳、關(guān)節(jié)營養(yǎng)的降低、自由基損傷、自身免疫損傷反應(yīng)、生物力學(xué)異常等多種因素有關(guān)[1]。關(guān)節(jié)軟骨由細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，EMC）和軟骨細(xì)胞組成，基質(zhì)主要由蛋白多糖和膠原纖維組成。膠原纖維是關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的重要組成成分，其中Ⅱ型膠原含量約占膠原總量的90%。而膠原纖維是關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)結(jié)構(gòu)的主要維持者，同時也是關(guān)節(jié)軟骨力學(xué)功能的主要承擔(dān)者[2]。軟骨破壞是OA發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，主要由軟骨EMC降解與合成明顯失衡而引起[3]，細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、自由基和細(xì)胞調(diào)亡等多種因素都涉及軟骨退行性變的發(fā)病機(jī)制[4-6]。

目前，針對OA的治療臨床上缺乏根治措施，長期使用非甾體抗炎藥不能阻止OA的病理發(fā)展且可導(dǎo)致軟骨損傷及嚴(yán)重的胃腸道不良反應(yīng)等[7]。近年來，已有用硫酸軟骨素[8]、氨基葡萄糖（glucosamine，GLU）[9]、維生素、礦物質(zhì)及一些植物提取物類，如鹿茸多肽[10]、骨碎補(bǔ)（drynaria rhizome，DR）[11]和蝦青素[12]等的單獨(dú)作用以及透明質(zhì)酸鈉和硫酸氨基葡萄糖（1 500 mg/d）[13]的聯(lián)合作用來預(yù)防和治療OA，在一定程度上均能夠減輕軟骨損傷，抑制OA病理進(jìn)程，且無明顯毒副作用。此外，GLU能刺激軟骨基質(zhì)的合成[14]，而DR則抑制其降解[15]，兩者聯(lián)用治療OA能否取得更好的效果，目前鮮見報道。

誘發(fā)OA動物模型有多種，有急性的、慢性的。關(guān)節(jié)腔注射誘發(fā)模型造模時間短，為最快形成的OA動物模型[16]，但是此類模型造成急性關(guān)節(jié)破壞，與人類OA病理進(jìn)程稍有差別，而運(yùn)動性損傷模型通過過度運(yùn)動導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷，關(guān)節(jié)的修復(fù)能力較差，一旦損傷即可造成永久性病變[17]。Lee等[18]通過迫使Wistar大鼠進(jìn)行跑臺運(yùn)動成功誘導(dǎo)了大鼠OA模型，其組織病理學(xué)變化與早期OA病理改變一致，此類模型符合人類退行性O(shè)A的病理發(fā)展過程，可作為研究OA的一種慢性模型。但將兩種造模方法聯(lián)合采用建立的OA模型鮮見報道。

因此，本研究采用關(guān)節(jié)腔注射白陶土-鹿角菜膠誘發(fā)各組大鼠急性骨關(guān)節(jié)損傷，結(jié)合跑臺運(yùn)動，建立大鼠慢性O(shè)A模型，研究GLU和DR聯(lián)用的干預(yù)作用及機(jī)制，為進(jìn)一步開展預(yù)防和治療OA的研究工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

選用6 周齡的160～180 g的SD雄性大鼠（SPF級），飼養(yǎng)于北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院保健食品功能檢測中心SPF級動物室（許可證號：SYXK（京）2012-0031）。基礎(chǔ)飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司（許可證號：SCXK（京）2014-012）生產(chǎn)。

DR提取物 北京綠色金可生物技術(shù)股份有限公司；GLU、雙氯芬酸鈉（diclofenac sodium，DS）、白陶土、λ-鹿角菜膠、番紅-O-固綠（saffron-O-solid green，SOFG）染料、蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE） 美國Sigma公司；中性樹膠 北京國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸抗原修復(fù)液（pH 6.0）、Tween 20 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；水合氯醛 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 南京建成生物工程研究所；大鼠白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、金屬基質(zhì)蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）、金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinases inhibitor-1，TIMP-1）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxidesynthase，iNOS）酶聯(lián)免疫吸附檢測（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒武漢華美生物科技有限公司；大鼠Ⅱ型膠原免疫組化檢測試劑盒 上海雅吉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZH-PT動物實驗跑臺 安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司；數(shù)顯卡尺 上海寶琴工具有限公司；UV-2450型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；多功能酶標(biāo)儀美國賽默飛世爾公司；MQX200微板分光光度計 美國伯騰儀器有限公司；病理制片系統(tǒng) 德國徠卡儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大鼠慢性O(shè)A模型的建立與實驗設(shè)計

造模方法：采用關(guān)節(jié)腔注射白陶土-鹿角菜膠誘發(fā)大鼠急性骨關(guān)節(jié)損傷[19]。方法如下：大鼠經(jīng)水合氯醛（350 mg/kg mb）腹腔注射麻醉后，右后肢膝關(guān)節(jié)部位常規(guī)消毒，然后用1 mL注射針穿過髕骨韌帶向膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入滅菌生理鹽水配制的40 mg/mL白陶土與20 mg/mL λ-鹿角菜膠的混懸液0.1 mL，并緩慢曲伸關(guān)節(jié)持續(xù)5 min。術(shù)后大鼠休息2 d，第3天各組大鼠在跑臺上以10～20 m/min慢速跑步30 min以適應(yīng)跑道。5 d后開始正式運(yùn)動，20 m/min，60 min/d，跑臺坡度為5°，運(yùn)動6 周后結(jié)束?？瞻捉M籠內(nèi)飼養(yǎng)，自由活動。

實驗設(shè)計：造模前開始按10 mL/kg mb灌胃給藥。單獨(dú)給藥分別為GLU單獨(dú)作用組（750 mg/kg GLU）、DR單獨(dú)作用組（150 mg/kg DR）；聯(lián)合給藥分別為高劑量組（750 mg/kg GLU＋150 mg/kg DR）、中劑量組（250 mg/kg GLU＋50 mg/kg DR）和低劑量組（125 mg/kg GLU＋25 mg/kg DR），同時設(shè)空白組和模型組（無菌水）以及陽性對照組（2 mg/kg DS），每天1 次，直至6 周跑臺運(yùn)動結(jié)束。各受試物的人體推薦劑量：標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量60 kg，1 500 mg/d GLU，300 mg/d DR；低、中、高劑量分別按人體推薦劑量的5、10、30 倍；單獨(dú)作用劑量為人體推薦劑量的30 倍。

1.3.2 動物處理與樣本采集

實驗結(jié)束后，100 mg/mL水合氯醛麻醉大鼠（4 mL/kg mb），股動脈取血后處死。取各組大鼠完整的右膝關(guān)節(jié)，修剪去除相連的軟組織，放入體積分?jǐn)?shù)10%中性緩沖福爾馬林中固定。全血標(biāo)本于室溫靜置30 min后，3 000 r/min離心15 min，取上清液，用于細(xì)胞因子檢測，若不能及時檢測，應(yīng)儲存于－20 ℃或－80 ℃。但應(yīng)避免反復(fù)凍融，解凍后的樣品應(yīng)再次離心，然后檢測。

1.3.3 大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度的測量

在造模后的第1～7周末，每天定時測量。用游標(biāo)卡尺測量每組大鼠右膝關(guān)節(jié)橫向直徑/mm，計算膝關(guān)節(jié)腫脹度/%[19]。

1.3.4 組織病理學(xué)檢查及評分

取出固定的大鼠右膝關(guān)節(jié)，用體積分?jǐn)?shù)5%甲酸-福爾馬林脫鈣，每日更換新鮮液，直至組織軟化為止，約為3～4 d。脫鈣完成后流水沖洗24 h（除酸），進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、浸蠟、切片。分別進(jìn)行HE[20]和SOFG[21]染色。顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞及EMC的染色情況和結(jié)構(gòu)的完整性。評分項目及標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[19]。

1.3.5 指標(biāo)測定

用ELISA法測定大鼠血清中IL-1β、TNF-α、MMP-3、TIMP-1質(zhì)量濃度和iNOS活力。采用黃嘌呤氧化酶法測定血清中SOD活力。采用硝酸還原酶法檢測血清中NO濃度。實驗操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

使用大鼠膠原ELISA試劑盒檢測關(guān)節(jié)軟骨組織Ⅱ型膠原纖維表達(dá)。采用Image-Pro plus 6.0圖像分析軟件，測定單位面積軟骨組織切片Ⅱ型膠原纖維免疫組化染色平均光密度值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 GLU和DR聯(lián)用對大鼠關(guān)節(jié)腫脹度的影響

表1 不同處理對大鼠關(guān)節(jié)腫脹度的影響（n＝ 6）Table 1 Effect of GLU and DR on arthroncus in rats (n= 6)

由表1可知，第1～7周，與空白組相比，模型組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度顯著增加，表明模型誘導(dǎo)成功；與模型組相比，DS組顯著降低，除了低劑量組外，其他各受試物組均顯著降低（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，GLU和DR單獨(dú)及聯(lián)合作用均能減輕大鼠關(guān)節(jié)腫脹損傷，單獨(dú)作用時GLU的作用效果優(yōu)于DR，聯(lián)合作用時高劑量的效果最好，且優(yōu)于2 種物質(zhì)單獨(dú)作用時的效果，中劑量的作用效果比DR略差一些，低劑量減輕關(guān)節(jié)腫脹損傷效果不明顯。

2.2 GLU和DR聯(lián)用對大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)改變的影響

2.2.1 HE染色的組織病理學(xué)征象

圖1 大鼠膝關(guān)節(jié)HE染色的組織病理學(xué)征象（×100）Fig. 1 Representative pathological features of knee joints in rats by HE staining (× 100)

由圖1可見，空白組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑、完整，軟骨層無裂縫、侵蝕；軟骨細(xì)胞規(guī)則排列于軟骨陷窩內(nèi)，呈柱狀排列，軟骨細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)無異常。模型組關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙、不平整，有裂縫，可深達(dá)放射層及鈣化層，部分軟骨層脫落，大范圍骨侵蝕和軟骨破壞；表層內(nèi)的軟骨細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞排列紊亂，放射層細(xì)胞則明顯增多，鈣化層可見肥大的軟骨細(xì)胞，有細(xì)胞團(tuán)存在，部分有血管翳形成。DS組的組織病理學(xué)所見則明顯輕于模型組，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨侵蝕較輕，細(xì)胞排列較規(guī)則，肥大樣細(xì)胞減少。各受試物組除低劑量組外大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)征象均明顯輕于模型組，其中，高劑量組組織病理學(xué)征象減輕最明顯，其次為GLU組、DR組和中劑量組。

2.2.2 SOFG染色觀察關(guān)節(jié)軟骨蛋白聚糖含量的變化

圖2 大鼠膝關(guān)節(jié)SOFG染色組織病理學(xué)征象（×100）Fig. 2 Representative pathological features of knee joints in rats by SOFG staining (× 100)

由圖2可知，空白組關(guān)節(jié)軟骨蛋白聚糖染色正常（顏色鮮紅且均勻）；模型組關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中蛋白聚糖染色重度減退，說明造模后大鼠關(guān)節(jié)軟骨EMC中蛋白聚糖含量明顯降低，模型誘導(dǎo)成功；與模型組相比，DS組蛋白聚糖染色缺失現(xiàn)象明顯減輕，各受試物組除低劑量組外，蛋白聚糖染色缺失現(xiàn)象均明顯改善。

2.2.3 組織病理學(xué)評分結(jié)果

表2 大鼠膝關(guān)節(jié)切片的組織病理學(xué)評分結(jié)果（n＝ 6）Table 2 Histopathological scores of knee joints in rats (n= 6)

由表2可見，模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨的各項組織病理學(xué)評分均顯著高于空白組（P＜0.05）。DS組的各項評分除軟骨細(xì)胞外均顯著低于模型組（P＜0.05）。GLU組、DR組、中、高劑量組各項評分均顯著低于模型組（P＜0.05）。低劑量組各項評分與模型組相比有所降低，但差異不明顯。以上結(jié)果表明，GLU和DR單獨(dú)及聯(lián)合作用均能改善大鼠組織病理學(xué)異?，F(xiàn)象，單獨(dú)作用時GLU的改善效果更好，聯(lián)合作用時高劑量的效果最好，優(yōu)于2 種物質(zhì)單獨(dú)作用時的效果，中劑量的改善效果比DR略差一些，低劑量對大鼠組織病理學(xué)異?，F(xiàn)象的改善效果不明顯。

2.3 GLU和DR聯(lián)用對MMP-3、TIMP-1水平的影響

如圖3A、B所示，與空白組相比，模型組大鼠血清中MMP-3和TIMP-1質(zhì)量濃度明顯升高；與模型組相比，DS組、GLU組、DR組、中、高劑量組MMP-3和TIMP-1質(zhì)量濃度均明顯降低，低劑量組MMP-3質(zhì)量濃度也有所降低，但差異不明顯。說明大鼠骨關(guān)節(jié)損傷時血清MMP-3表達(dá)增高，模型誘導(dǎo)成功，GLU和DR單獨(dú)和聯(lián)合作用對MMP-3和TIMP-1質(zhì)量濃度的升高均具有一定的抑制作用，單獨(dú)作用時GLU的抑制作用更明顯，聯(lián)合作用時高劑量組抑制作用最明顯，優(yōu)于DS組及其他受試物組。

如圖3C所示，與空白組相比，模型組大鼠血清MMP-3/TIMP-1質(zhì)量濃度比值明顯降低；與模型組相比，DS、DR組和低劑量組有所降低，但差異不明顯，其余各受試物組均明顯小于模型對照組。說明大鼠發(fā)生OA時血清TIMP-1、MMP-3表達(dá)均升高，但兩者升高幅度不平行，導(dǎo)致MMP-3與TIMP-1質(zhì)量濃度失衡，GLU和DR單獨(dú)作用對MMP-3與TIMP-1之間失衡都有調(diào)節(jié)作用，聯(lián)合作用時中、高劑量調(diào)節(jié)作用較明顯，低劑量沒有明顯調(diào)節(jié)作用。

圖3 各組大鼠血清MMP-3（A）、TIMP-1（B）質(zhì)量濃度和MMP-3/TIMP-1質(zhì)量濃度比值（C）的比較Fig. 3 Comparison of the levels of MMP-3 (A) and TIMP-1 (B) and MMP-3/TIMP-1 ratio (C) in serum of rats

2.4 GLU和DR聯(lián)用對iNOS活力和NO濃度的影響

如圖4所示，與空白組相比，模型組大鼠血清中iNOS活力和NO濃度顯著增加；與模型組相比，除低劑量組外，DS組和各受試物組iNOS活力和NO濃度均明顯降低；各受試物組相比，GLU和DR單獨(dú)作用和聯(lián)合作用中、高劑量組大鼠血清iNOS活力和NO濃度均明顯低于低劑量組（P＜0.05）。說明GLU和DR單獨(dú)和聯(lián)合作用對OA大鼠血清iNOS活力和NO濃度的升高均具有一定的抑制作用，聯(lián)合作用時，中、高劑量組有明顯的降低作用，低劑量組的作用效果不明顯。

圖4 各組大鼠血清iNOS活力（A）和NO濃度（B）的比較Fig. 4 Comparison of iNOS activity (A) and NO level (B) in serum of rats

2.5 GLU和DR聯(lián)用對SOD活力的影響

圖5 各組大鼠血清SOD活力的比較Fig. 5 Comparison of SOD activity in serum of rats

如圖5所示，與空白組相比，模型組大鼠血清SOD活力明顯降低；與模型組相比，DS組SOD活力升高，但不明顯，除低劑量組外，其他各受試物組SOD活力明顯升高；說明關(guān)節(jié)腔注射聯(lián)合跑臺運(yùn)動誘發(fā)大鼠發(fā)生氧化損傷，GLU和DR單獨(dú)和聯(lián)合作用對OA大鼠血清SOD活力的降低均具有一定的抑制作用，其中高劑量的作用效果最明顯，其次為GLU、DR和中劑量，低劑量的作用效果不顯著。

2.6 GLU和DR聯(lián)用對關(guān)節(jié)軟骨組織Ⅱ型膠原含量的影響

圖6 大鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原免疫組化染色觀察（×100）Fig. 6 Immunohistochemical staining of type Ⅱ collagen of articular lamella in rats (× 100)

如圖6所示，空白組大鼠關(guān)節(jié)軟骨EMCⅡ型膠原染色呈棕色，陽性染色面積廣泛，均勻分布于關(guān)節(jié)軟骨各層，軟骨層可見軟骨細(xì)胞染色陽性；模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨層變薄，表淺層出現(xiàn)缺損，EMC染色淺，陽性染色面積顯著減少，且分布不均勻，軟骨細(xì)胞少量著色。與模型組相比，DS組大鼠關(guān)節(jié)軟骨EMC染色加深，染色面積增大，軟骨層可見陽性細(xì)胞增多；各受試物組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞陽性染色增多，EMC染色面積增大，染色有不同程度加深。

圖7 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達(dá)的比較Fig. 7 Comparison of average optical density of type Ⅱ collagen in articular cartilage of rats

如圖7所示，與空白組相比，模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原平均光密度值明顯降低。與模型組相比，DS組Ⅱ型膠原平均光密度值明顯升高；各受試物組除低劑量組外Ⅱ型膠原平均光密度值均明顯升高；說明大鼠發(fā)生OA時關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原含量明顯減少，GLU和DR對OA大鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原含量的減少均具有明顯改善作用，單獨(dú)作用時GLU的改善效果更明顯，優(yōu)于DR和DS，聯(lián)合作用時高劑量的效果最優(yōu)，且優(yōu)于GLU，低劑量的改善效果不明顯。

2.7 GLU和DR聯(lián)用對炎性細(xì)胞因子質(zhì)量濃度的影響

圖8 各組大鼠血清IL-1β（A）、TNF-α（B）質(zhì)量濃度的比較Fig. 8 Comparison of IL-1β (A) and TNF-α (B) concentration in serum of rats from all groups

由圖8可見，與空白組相比，模型組大鼠血清中TNF-α和IL-1β質(zhì)量濃度均明顯升高。與模型組相比，DS組TNF-α和IL-1β質(zhì)量濃度明顯降低；除低劑量組外，各受試物組血清TNF-α和IL-1β質(zhì)量濃度均明顯降低；低劑量組血清TNF-α、IL-1β質(zhì)量濃度有所降低，但差異不顯著。說明誘發(fā)大鼠OA后，大鼠產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，血清炎性因子TNF-α和IL-1β水平明顯升高，GLU和DR均能明顯降低大鼠血清炎性因子IL-1β、TNF-α水平，GLU的降低效果更明顯，聯(lián)合作用時高劑量的效果最明顯，且優(yōu)于2種物質(zhì)單獨(dú)作用效果，低劑量組的作用效果不明顯。

3 討 論

OA為一種退行性骨關(guān)節(jié)病，其病變的核心是關(guān)節(jié)軟骨破壞[22]。OA的發(fā)病機(jī)制與軟骨細(xì)胞、EMC及軟骨下骨三者降解和合成失衡有關(guān)[3]，這種失衡與炎性因子介導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和壓力機(jī)制等密切相關(guān)。GLU是一種天然的氨基單糖，可刺激軟骨細(xì)胞合成蛋白聚糖以補(bǔ)充軟骨基質(zhì)的流失，刺激關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的再生，從而改善關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)，促進(jìn)軟骨組織的修復(fù)[4]，同時可抑制炎癥因子的生成，阻斷炎性物質(zhì)的擴(kuò)散途徑，在一定程度上延緩OA的病理進(jìn)程[23]。DR是水龍骨科多年生蕨類植物，具有補(bǔ)腎堅骨、活血止痛的功效[24]，能改善軟骨細(xì)胞的生理病理狀態(tài)，有效抑制關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞凋亡，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)的恢復(fù)，從而緩解關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變[25]。本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組關(guān)節(jié)軟骨組織可見炎性細(xì)胞浸潤、滑膜細(xì)胞與纖維組織增生以及關(guān)節(jié)軟骨與骨破壞，關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中蛋白聚糖染色重度減退。灌胃受試物組，除了低劑量組外，大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)征象均明顯輕于模型組，其中，高劑量組減輕最明顯，其次為GLU組、DR組和中劑量組。說明GLU和DR單獨(dú)和聯(lián)用均可抑制緩解軟骨破壞。

目前普遍認(rèn)為，多種MMPs對關(guān)節(jié)軟骨EMC有降解作用，使關(guān)節(jié)軟骨腫脹，抗外力作用下降。Freemont等[26]發(fā)現(xiàn)MMP-1主要在軟骨表層表達(dá)增高，而MMP-3與-9則在軟骨深層表達(dá)較高，其中MMP-9在OA的早期表達(dá)增高明顯，而MMP-3則在OA的早期和晚期表達(dá)增高明顯。軟骨細(xì)胞分泌的MMP-3底物廣泛[27]，可降解基質(zhì)中的蛋白多糖及其Ⅱ型膠原纖維[28]。蛋白多糖和Ⅱ型膠原的質(zhì)和量的改變是引起關(guān)節(jié)軟骨退變繼而發(fā)生OA的直接原因，可作為反映軟骨基質(zhì)損傷的良好指標(biāo)[29]。目前發(fā)現(xiàn)的TIMP中，TIMP-1的分布最為廣泛，是MMPs最為主要的拮抗劑。MMP-3和TIMP-1關(guān)系失衡促進(jìn)關(guān)節(jié)細(xì)胞降減，軟骨退變，導(dǎo)致OA的發(fā)生[30]。Liu Qingguo等[31]發(fā)現(xiàn)，在關(guān)節(jié)軟骨急劇退變兔中，血清MMP-3濃度明顯上升。在OA患者的關(guān)節(jié)軟骨組織中TIMPs與MMPs的失衡，會導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能的嚴(yán)重?fù)p害[32]。在本實驗中，與空白組相比，模型組血清中MMP-3和TIMP-1的質(zhì)量濃度增加，MMP-3/TIMP-1失衡，而且基質(zhì)中蛋白多糖和Ⅱ型膠原含量下降。而受試物組MMP-3和TIMP-1的質(zhì)量濃度下降，說明GLU和DR單獨(dú)作用對MMP-3與TIMP-1之間失衡都有調(diào)節(jié)作用，聯(lián)合作用時中、高劑量調(diào)節(jié)作用更為明顯，低劑量沒有明顯的調(diào)節(jié)作用。

IL-1β、TNF-α都是機(jī)體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)骨代謝的主要蛋白質(zhì)因子，是參與OA發(fā)病進(jìn)程中的重要介質(zhì)，是炎癥反應(yīng)的始動因素。IL-1β和TNF-α可以起到協(xié)同作用，介導(dǎo)關(guān)節(jié)組織的破壞，并與OA軟骨破壞嚴(yán)重程度相關(guān)[33-35]。細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α通過刺激軟骨細(xì)胞退變，刺激滑膜細(xì)胞分泌前列腺素E2，引起基質(zhì)降解酶尤其是MMPs家族的產(chǎn)生，抑制Ⅱ型膠原的合成[36-37]，在OA發(fā)病和進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。IL-1β也可以刺激產(chǎn)生IL-1β本身和TNF-α，引起一系列的生物學(xué)效應(yīng)[38]。何忠斌等[39]研究發(fā)現(xiàn)鹽酸氨基葡萄糖能抑制膝關(guān)節(jié)炎患者血清IL-1β、TNF-α和MMP-9的表達(dá)，改善膝關(guān)節(jié)功能，達(dá)到治療的作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，誘發(fā)大鼠OA后，大鼠產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，血清炎性因子TNF-α和IL-1β水平明顯升高，GLU和DR均能明顯降低大鼠血清炎性因子IL-1β、TNF-α水平，GLU的降低效果更明顯，聯(lián)合作用時高劑量的效果最明顯，且優(yōu)于2種物質(zhì)單獨(dú)作用效果，低劑量組的作用效果不明顯。

自由基可以加重和延長炎癥過程，在炎癥的發(fā)展過程中起重要作用。NO是活潑的自由基分子，參與多種組織的代謝調(diào)節(jié)。研究證實關(guān)節(jié)炎軟骨表達(dá)iNOS mRNA并導(dǎo)致NO過量釋放，而過量NO可增加膠原酶和金屬蛋白酶的活性，抑制基質(zhì)蛋白多糖的合成，增加Ⅱ型膠原的裂解，而且增加的NO又具有協(xié)同各種細(xì)胞因子的作用，從而造成關(guān)節(jié)軟骨的損傷[40-41]。NO是IL-1β作用于軟骨細(xì)胞最主要的效應(yīng)分子，又具有神經(jīng)遞質(zhì)和第二信使的功能，參與多種生理和病理過程[42]。SOD作為體內(nèi)抗氧化酶之一，可清除氧自由基和其分解產(chǎn)物，能修復(fù)自由基對軟骨細(xì)胞的損傷，可作為評價OA防治效果的客觀指標(biāo)[43]。郝小金等[44]通過觀察比較功效不同的4組補(bǔ)腎活血“對藥”在OA病變過程中存在的作用差異，發(fā)現(xiàn)牛膝＋澤蘭組、補(bǔ)骨脂＋DR組及聯(lián)合組均可降低細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、自由基NO濃度及提高SOD活性，熟地＋鹿角組效果不明顯，而牛膝、澤蘭組作用優(yōu)于其他各組，說明在膝OA早期炎癥、局部血液循環(huán)障礙，可能是重要的致病因素。本實驗發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，模型組大鼠血清中iNOS活力和NO濃度增加；SOD活力降低。給予受試物后，iNOS活力和NO濃度減少，SOD活力增加。說明GLU和DR可以通過減輕氧化損傷、減緩關(guān)節(jié)損傷。

在本實驗中，研究GLU和DR聯(lián)合作用對大鼠OA的干預(yù)作用及機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)：GLU和DR單獨(dú)和聯(lián)合作用均能減輕大鼠關(guān)節(jié)腫脹損傷，改善大鼠組織病理學(xué)異常現(xiàn)象；抑制大鼠血清MMP-3和TIMP-1質(zhì)量濃度的升高，調(diào)節(jié)MMP-3/TIMP-1失衡；抑制iNOS活力和NO、IL-1β、TNF-α水平的增加；抑制關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原含量和SOD活力的降低。單獨(dú)作用以GLU的效果較好。GLU和DR聯(lián)合作用時高劑量的效果最好，優(yōu)于單獨(dú)作用效果，低劑量的效果最差。2 種物質(zhì)單獨(dú)作用時，按人體推薦量的30 倍給藥；聯(lián)合作用時，按人體推薦量的30、10、5 倍給藥。說明GLU和DR單獨(dú)和聯(lián)合作用都能夠減輕骨關(guān)節(jié)損傷，聯(lián)合作用需要達(dá)到有效作用劑量才有明顯的抑制作用。其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)軟骨EMC合成、降解失衡（MMP-3、TIMP-1質(zhì)量濃度降低，蛋白多糖和Ⅱ型膠原含量增加），減輕大鼠滑膜組織氧化損傷（NO濃度、iNOS活力降低，SOD活力增加）及炎性損傷（IL-1β、TNF-α質(zhì)量濃度降低）有關(guān)。這些研究為預(yù)防和治療OA功能性食品的研發(fā)提供了理論依據(jù)。

[1] 豐哲, 肖茜, 練克儉. Wnt信號通路與骨關(guān)節(jié)炎的研究進(jìn)展[J]. 吉林醫(yī)學(xué), 2017, 38(2): 383-386. DOI:10.3969/j.issn.1004-0412.2017.02.093.

[2] VILAR J M, RUBIO M, SPINELLA G, et al. Serum collagen type Ⅱcleavage epitope and serum hyaluronic acid as biomarkers for treatment monitoring of dogs with hip osteoarthritis[J]. PLoS ONE, 2016, 11(2):e0149472. DOI:10.1371/journal.pone.0149472.

[3] STOCK M, MENGES S, EITZINGER N, et al. A dual role for UCMA in osteoarthritis-inhibition of aggrecanases and promotion of bone turnover[J]. Arthritis & Rheumatology, 2017, 69(6): 1233-1245.DOI:10.1002/art.40042.

[4] CHAN D D, XIAO W F, LI J, et al. Deベciency of hyaluronan synthase 1(Has1) results in chronic joint inflammation and widespread intraarticular fibrosis in a murine model of knee joint cartilage damage[J].Osteoarthritis and Cartilage, 2015, 23(11): 1879-1889. DOI:10.1016/j.joca.2015.06.021.

[5] JOO H E, LEE H J, SHIN E A, et al. c-Jun N-terminal kinase-dependent endoplasmic reticulum stress pathway is critically involved in arjunic acid induced apoptosis in non-small cell lung cancer cells[J]. Phytotherapy Research, 2016, 30(4): 596-603. DOI:10.1002/ptr.5563.

[6] TAKAHASHI K, HASHIMOTO S, KUROSAKI H, et al. A pilot study comparing the efficacy of radiofrequency and microwave diathermy in combination with intra-articular injection of hyaluronic acid in knee osteoarthritis[J]. Journal of Physical Therapy Science, 2016, 28(2): 525-529. DOI:10.1589/jpts.28.525.

[7] BALMACEDA C M. Evolving guidelines in the use of topical nonsteroidal anti-inぼammatory drugs in the treatment of osteoarthritis[J].BMC Musculoskeletal Disorders, 2014, 15(1): 27. DOI:10.1186/1471-2474-15-27.

[8] RAILHAC J J, ZAIM M, SAUREL A S, et al. Effect of 12 months treatment with chondroitin sulfate on cartilage volume in knee osteoarthritis patients: a randomized, double-blind, placebo-controlled pilot study using MRI[J]. Clinical Rheumatology, 2012, 31(9): 1347-1357.DOI:10.1007/s10067-012-2022-4.

[9] HENROTIN Y, MOBASHERI A, MARTY M. Is there any scientific evidence for the use of glucosamine in the management of human osteoarthritis?[J]. Arthritis Research & Therapy, 2012, 14(1): 201.DOI:10.1186/ar3657.

[10] 修忠標(biāo), 孫磊. 鹿茸多肽對實驗性膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡及相關(guān)細(xì)胞因子的影響[J]. 中國骨傷, 2012, 25(5): 418-423. DOI:10.3969/j.issn.1003-0034.2012.05.017.

[11] WONG R W K, RABIE A B M. Systemic effect of crude extract from rhizome of drynaria fortunei on bone formation in mice[J]. Phytotherapy Research, 2006, 20(4): 313-315. DOI:10.1002/ptr.1842.

[12] HUANG L J, CHEN W P. Astaxanthin ameliorates cartilage damage in experimental osteoarthritis[J]. Japanese Journal of Rheumatology, 2015,25(5): 768-771. DOI:10.3109/14397595.2015.1008724.

[13] 王亞麗. 透明質(zhì)酸鈉聯(lián)合硫酸氨基葡萄糖治療膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床觀察[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報, 2011, 8(20): 121-122. DOI:10.3969/j.issn.1673-7210.2011.20.056.

[14] 傅欣, 林霖, 魏學(xué)磊, 等. 氨基葡萄糖和硫酸軟骨素聯(lián)合用藥對兔骨關(guān)節(jié)炎治療作用實驗研究[J]. 中國運(yùn)動醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 27(5): 588-592. DOI:10.3969/j.issn.1000-6710.2008.05.011.

[15] 秦楚, 李沛. 補(bǔ)腎中藥干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 中醫(yī)學(xué)報,2012, 27(1): 76-78. DOI:10.16368/j.issn.1674-8999.2012.01.055.

[16] AIGNER T, COOK J L, GERWIN N, et al. Histopathology atlas of animal model systems: overview of guiding principles[J]. Osteoarthritis and Cartilage, 2010, 18 (Suppl 3): 2-6. DOI:10.1016/j.joca.2010.07.013.

[17] NI G X, LEI L, ZHOU Y Z. Intensity-dependent effect of treadmill running on lubricin metabolism of rat articular cartilage[J]. Arthritis Research and Therapy, 2012, 14(6): 256. DOI:10.1186/ar4101.

[18] LEE Y J, PARK J A, YANG S H, et al. Evaluation of osteoarthritis induced by treadmill-running exercise using the modiベed mankin and the new OARSI assessment system[J]. Rheumatology International, 2011,31(12): 1571-1576. DOI:10.1007/s00296-010-1520-4 .

[19] 陳世杰, 勞文艷, 周艷麗, 等. 氨基葡萄糖、骨碎補(bǔ)和蝦青素對大鼠急性骨關(guān)節(jié)炎的干預(yù)研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2017, 38(4): 365-369;378. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.061.

[20] 劉志翔, 張柳, 張楠. 降鈣素對兔骨關(guān)節(jié)炎軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶1的影響[J]. 中國矯形外科雜志, 2006, 14(22): 1741-1743; 1764.DOI:10.3969/j.issn.1005-8478.2006.22.020.

[21] MASUHARA K, NAKAI T, YAMAGUCHI K, et al. Signiベcant increases in serum and plasma concentrations of matrix metalloproteinases 3 and 9 in patients with rapidly destructive osteoarthritis of the hip[J]. Arthritis &Rheumatism, 2002, 46(10): 2625-2631. DOI:10.1002/art.10547.

[22] HEIJINK A, VANHEES M, VAN DEN ENDE K, et al. Biomechanical considerations in the pathogenesis of osteoarthritis of the elbow[J]. Knee Surgery Sports Traumatology Arthroscopy, 2016, 24(7): 2313-2318.DOI:10.1007/s00167-015-3518-7.

[23] KANZAKI N, SAITO K, MAEDA A, et al. Effect of a dietary supplement containing glucosamine hydrochloride, chondroitin sulfate and quercetin glycosides on symptomatic knee osteoarthritis: a randomized, double-blind, placebo-controlled study[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2012, 92(4): 862-869. DOI:10.1002/jsfa.4660.

[24] 陳瑤, 劉忠良, 趙勇. 骨碎補(bǔ)化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J]. 解放軍藥學(xué)學(xué)報, 2012, 28(5): 454-457. DOI:10.3969/j.issn.1008-9926.2012.05.24.

[25] 鄭忠輝. 骨碎補(bǔ)對骨性關(guān)節(jié)炎家兔實驗研究[D]. 沈陽: 遼寧中醫(yī)藥大學(xué), 2015: 23-25.

[26] FREEMONT A J, HAMPSON V, TILMAN R, et al. Gene expression of matrix metallc: proteinases 1, 3 and 9 by chondrocytes in osteoarthritie human knee articular cartilage is zone and grade speciベc[J]. Annals of the Rheumatic Diseases, 1997, 56(9): 542-548. DOI:10.1136/ard.56.9.542.

[27] 談志龍, 邢國勝, 李德達(dá), 等. 細(xì)胞因子對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞作用的研究[J]. 骨與關(guān)節(jié)損傷雜志, 2003, 18(5): 316-318. DOI:10.3969/j.issn.1672-9935.2003.05.012.

[28] LOHMANDER L S, BRANDT K D, MAZZUCA S A, et al. Use of the plasma stromelysin (matrix metalloproteinase 3) concentration to predict joint space narrowing in knee osteoarthritis[J]. Arthritis & Rheumatism,2005, 52(10): 3160-3167. DOI:10.1002/art.21345.

[29] TCHETVERIKOV I, LOHMANDER L S, VERZIJL N, et al. MMP protein and activity levels in synovial ぼuid from patients with joint injury,inflammatory arthritis, and osteoarthritis[J]. Annals of the Rheumatic Diseases, 2005, 64(5): 694-698. DOI:10.1136/ard.2004.022434.

[30] ZHANG J S, CHENG Y Y, LIU J. The changes and correlations of MMP-3, TIMP-1 in knee osteoarthritis patients[J]. Acta Universitatis Medicinalis Anhui, 2012, 15 (3): 3989-4006.

[31] LIU Qingguo, JI Bo, QIN Weilan, et al. Effect of acupotomy lysis on serum matrix metalloproteinase (MMP)-3 and MMP-13 contents in osteoarthritis rabbits[J]. Acupuncture Research, 2008, 33(5): 306-309.

[32] REMST D F, BLOM A B, VITTERS E L, et al. Gene expression analysis of osteoarthritis synovium reveals elevation of transforming growth factor-beta responsive genes in osteoarthritis-related ベbrosis[J]. Arthritis& Rheumatology, 2014, 66(3): 647-656. DOI:10.1002/art.38266.

[33] 帥明, 林荔軍, 林昭偉, 等. IL-1β、HIF-1α和VEGF在兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型滑膜中的表達(dá)[J]. 中國老年學(xué)雜志, 2013, 33(10): 2311-2313. DOI:10.3969/j.issn.1005-9202.2013.10.036.

[34] 葉茂, 黃敬東, 吳新興, 等. 鹿瓜多肽注射液治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎療效及對血清中TNF-α和IL-23的影響[J]. 現(xiàn)代診斷與治療, 2013,24(6): 1204-1205. DOI:10.3969/j.issn.1001-8174.013.06.003.

[35] 王雷, 齊磊, 辛榮超. 鹽酸氨基葡萄糖對兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)液中白細(xì)胞介素1和白細(xì)胞介素6及腫瘤壞死因子水平的影響[J]. 中國醫(yī)藥, 2017, 12(1): 126-129. DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4777.2017.01.030.

[36] HULEIOVáH, BARESOVáV, KLéZL Z, et al. Increased level of cytokines and matrix metalloproteinase in osteoarthritic subchondral bone[J]. Cytokine, 2007, 38(3): 151-156. DOI:10.1016/j.cyto.2007.06.001.

[37] 張鐵峰, 李景峰. 細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中mRNA表達(dá)的變化及意義[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生, 2008, 46(15): 116-117.DOI:10.3969/j.issn.1673-9701.2008.15.050.

[38] ZWERINA J, REDLICH K, POLZER K, et al. TNF-induced structural joint damage is mediated by IL-1[J]. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of American, 2007, 104(28): 11742-11747. DOI:10.1073/pnas.0610812104.

[39] 何忠斌, 朱海波. 鹽酸氨基葡萄糖對膝骨關(guān)節(jié)炎患者血清IL-1β、MMP-9和TNF-α表達(dá)的影響和臨床療效[J]. 醫(yī)學(xué)理論與實踐, 2015,28(12): 1566-1567; 1570.

[40] LOTZ M. The role of nitric oxide in articular cartilage damage[J].Rheumatic Disease Clinics of North America, 1999, 25(2): 269-282.DOI:10.1016/S0889-857X(05)70067-3.

[41] 金大地, 孫煒, 王吉興, 等. 一氧化氮合酶抑制劑對骨關(guān)節(jié)炎的潛在治療意義[J]. 中華骨科雜志, 2002, 22(6): 367-371. DOI:10.3760/j.issn:0253-2352.2002.06.013.

[42] 莘曉陶, 張志純. 一氧化氮在骨缺損愈合中的作用[J]. 社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 5(11): 68-70. DOI:10.3969/j.issn.1672-4208.2007.11.042.

[43] HENROTIN Y, KURZ B. Antioxidant to treat osteoarthritis:dream or reality?[J]. Current Drug Targets, 2007, 8(2): 347-357.DOI:10.2174/138945007779940151.

[44] 郝小金, 馮文進(jìn), 郝華, 等. 補(bǔ)腎活血“對藥”對兔膝骨關(guān)節(jié)炎NO、SOD、IL-1和TNF-α水平的影響[J]. 北京中醫(yī)藥, 2010, 29(5): 380-381.