白姍姍，張瑩瑩，趙 強，劉玉梅*

啤酒花（Humulus lupulus L.）是啤酒釀造過程中不可缺少的原料之一，被譽為“啤酒的靈魂”，同時具有健胃、消食等功效，可用于治療癔病、膀胱炎、肺結(jié)核等[1-5]，主要化學(xué)成分為樹脂類[6]、揮發(fā)油[7-8]、多酚類[9-10]、黃酮類[11]等，其中多酚和黃酮類化合物具有很強的抗菌、抗炎、抗氧化等作用，也是各種植物中的主要抗氧化活性成分[12]。中國啤酒花產(chǎn)量位居世界第3，僅次于美國、德國，新疆則是我國啤酒花最大的產(chǎn)區(qū)[13-14]。啤酒花采摘期間會產(chǎn)生大量的廢棄枝葉，對其活性成分的研究和開發(fā)對發(fā)展新疆的經(jīng)濟具有重要的意義。前期研究發(fā)現(xiàn)，啤酒花廢棄枝葉中含有豐富的營養(yǎng)成分，并具有一定的抗氧化活性[15]，但抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。因此，對啤酒花廢棄枝葉抗氧化活性成分的深入研究，可以為開發(fā)利用啤酒花廢棄枝葉提供理論依據(jù)。

本實驗以新疆大面積種植的香型花札一和高酸型花馬可波羅2 個品種的廢棄枝葉為原料，并根據(jù)采摘部位將其分為主枝、側(cè)枝和葉子，分別以乙醇提取其活性成分，后經(jīng)氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取得不同極性部位，通過羥自由基（?OH）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除實驗、β-胡蘿卜素-亞油酸法及磷鉬酸法4 個評價體系，研究其醇提取物及不同極性部位的抗氧化能力，結(jié)合樣品中多酚及黃酮含量的相關(guān)性分析，對啤酒花廢棄枝葉進行綜合分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

札一、馬可波羅啤酒花廢棄枝葉由新疆三寶樂農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，實驗室分選為主枝、側(cè)枝和葉子3 類樣品，40 ℃烘干、粉碎、過40 目篩，備用。

DPPH 美國Sigma-Aldrich公司；沒食子酸中國藥品生物制品檢定所；蘆丁 北京化學(xué)試劑公司；2,6-二叔丁基對甲酚（2,6-di-tert-butyl-p-cresol，BHT）、β-胡蘿卜素、吐溫40、亞油酸、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、質(zhì)量分數(shù)30%過氧化氫、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鉬酸銨、氯化鈉、濃硫酸、無水甲醇、無水乙醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-100VED型三頻數(shù)控超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；BS210S型電子天平 德國賽多利斯公司；DHP-420型電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；UV-5300PC型紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；DHG-9075A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Anke.TGL-16G型離心機上海安亭科學(xué)儀器廠；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 啤酒花廢棄枝葉浸膏的提取

取札一、馬可波羅啤酒花的主枝、側(cè)枝及葉子（葉子預(yù)先以石油醚脫脂），用質(zhì)量分數(shù)5%的NaCl溶液脫蛋白，以料液比1∶30（m/V）加入50%（體積分數(shù)，下同）乙醇溶液，超聲波輔助提取10 min后，在60 ℃條件下浸提50 min，重復(fù)上述操作2 次，合并濾液，濃縮得浸膏，各提取物的浸膏得率見表1。準確稱取一定量的浸膏，加水分散得乙醇提取物（ethanol extract，EE），再依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液分別回收溶劑后，得氯仿萃取物（chloroform extracts，CE）、乙酸乙酯萃取物（ethyl acetate extracts，EAE）、正丁醇萃取物（n-butanol extracts，NBE）和水相萃取物（water extracts，WE），萃取流程見圖1。將上述各萃取物分別用50%乙醇溶解并定容至25 mL，冷藏，用于后續(xù)多酚、黃酮含量的測定及抗氧化實驗（各測試樣品的質(zhì)量濃度可依據(jù)浸膏得率計算）。測試前將樣品恢復(fù)至室溫后根據(jù)需要進行相應(yīng)的稀釋處理。

表1 啤酒花廢棄枝葉浸膏得率Table 1 Yields of ethanol extracts from abandoned hop branches and leaves

1.3.2 總多酚含量的測定

采用福林-酚比色法[16-18]，以干燥至恒質(zhì)量的沒食子酸為標準品，以A760nm對沒食子酸質(zhì)量濃度（ρ）進行線性回歸，得標準曲線方程為A760nm＝0.011 8ρ-0.053 6，R＝0.997 8，線性范圍為8.86～106.32 mg/L。

1.3.3 總黃酮含量的測定

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[19-20]，以干燥至恒質(zhì)量的蘆丁為標準品，以A510nm對蘆丁質(zhì)量濃度（ρ）作圖，得線性回歸方程A510nm＝15.164 5ρ-0.002 0，R＝0.999 3，線性范圍為8.73～69.82 mg/L。

1.3.4 清除?OH活性測定

采用鄰二氮菲-Fe2＋氧化法評價樣品清除?OH能力[21]，以BHT（0.06～0.24 mg/mL）為對照。

式中：E為?OH清除率/%；A樣是加樣品時溶液的吸光度；A損是以重蒸水代替樣品溶液時溶液的吸光度；A未是以重蒸水代替樣品和質(zhì)量分數(shù)0.01% H2O2時溶液的吸光度。

1.3.5 清除DPPH自由基活性測定

DPPH自由基清除實驗參照文獻[22-23]的方法，以BHT（0.06～0.60 mg/mL）為對照。

式中：D為DPPH自由基清除率/%；A1為加樣品時溶液的吸光度；A0為未加樣品時溶液的吸光度。

1.3.6 β-胡蘿卜素-亞油酸體系抗氧化活性測定

根據(jù)文獻[24]的方法，以BHT（0.10×10-4～0.10 mg/mL）為對照，以抗氧化指數(shù)（antioxidant activity index，AAI）的大小來反映抗氧化劑總抗氧化能力的強弱。

式中：A樣t、A空t分別表示120 min時樣品和空白的吸光度；A樣0、A空0分別表示0 min時樣品和空白的吸光度。

1.3.7 磷鉬酸體系抗氧化活性實驗

按文獻[25]方法，以0.75 mg/mL的VC為對照，以抗氧化能力（antioxidant activity，AA）的大小來反映抗氧化劑總抗氧化能力的強弱。

式中：A0和A1分別表示VC和樣品在820 nm波長處的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)實驗結(jié)果的平均值。采用OriginPro 8.6或SPSS 16.0軟件處理數(shù)據(jù)，并用ANOVA和鄧肯氏多重差異分析（P＜0.05）。所有實驗數(shù)據(jù)均表示為。

2 結(jié)果與分析

2.1 啤酒花枝葉中多酚、黃酮含量

多酚和黃酮類化合物在自然界中分布廣泛，且具有較強的抗氧化活性。該兩類化合物的極性范圍較寬，可以從不同極性的溶劑中萃取得到。因此，不同極性部位所得到的多酚、黃酮類化合物的種類及含量也會有所差異。札一和馬可波羅啤酒花不同極性部位的多酚、黃酮含量分別見表2、3。

表2 各樣品多酚的含量Table 2 Contents of polyphenols in different solvent extracts

表3 各樣品黃酮的含量Table 3 Contents of ぼavonoids in different solvent extracts

由表2、3可知，啤酒花枝葉中均含有一定量的多酚和黃酮類化合物。札一枝干中多酚、黃酮含量均高于馬可波羅，而葉子中的含量均較低。同一樣品中EAE的多酚、黃酮含量均高于CE、NBE和WE，這與張強等[26]對杜仲葉提取物不同極性部位多酚含量研究的結(jié)果一致。不同極性部位相比較發(fā)現(xiàn)，EAE的多酚、黃酮含量均顯著高于EE（P＜0.05），札一枝干和馬可波羅主枝的NBE中多酚、黃酮含量也高于EE，表明經(jīng)不同極性溶劑萃取后多酚、黃酮物質(zhì)在EAE部位和札一枝干、馬可波羅主枝的NBE部位得到富集。

2.2 啤酒花枝葉提取物對?OH清除活性的比較

由圖2可知，各樣品對?OH均有一定的清除能力，且表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。在枝干中，清除?OH的能力均為EAE最強，WE最弱；而在葉子中，EAE、CE的清除能力最強，NBE次之，但均顯著高于WE。

圖2 各樣品清除?OH能力Fig. 2 Hydroxyl radical scavenging capacity of different solvent extracts

表4 各樣品清除?OH的IC50值Table 4 IC50 for hydroxyl radical scavenging activity

清除?OH的能力通常以50%清除率時的樣品質(zhì)量濃度，即IC50值來衡量，IC50值越小，樣品抗氧化活性越強。由表4的IC50值可知，對2種啤酒花葉子極性部位提取物而言，除WE對?OH清除能力較差外，其他極性部位對?OH清除能力的差異不顯著（P＞0.05），略低于對照品BHT（IC50值為（0.18±0.01）mg/mL）?？傮w而言，EAE部位清除?OH能力較強，該結(jié)論與王春景等[27]研究雞眼草和劉瓊等[28]研究傣藥竹葉蘭的結(jié)果類似。

2.3 啤酒花枝葉提取物對DPPH自由基清除作用的比較

圖3 各樣品清除DPPH自由基能力Fig. 3 DPPH radical scavenging activity of different solvent extracts

由圖3可知，各樣品對DPPH自由基均有一定的清除能力。當枝干樣品質(zhì)量濃度為0～5 mg/mL時，清除率隨質(zhì)量濃度的增大而增大，超過5 mg/mL時，清除率趨于平緩，說明測試體系內(nèi)DPPH自由基已基本清除完全。

表5 各樣品清除DPPH自由基的IC50值Table 5 IC50 for DPPH radical scavenging activity

由表5的IC50值可知，樣品枝葉中EAE清除DPPH自由基的能力均最強，主枝中CE最弱，側(cè)枝和葉子中WE最弱，且均低于對照組BHT（IC50值為（0.25±0.01）mg/mL）。對同一樣品的同一極性部位而言，枝干部分清除DPPH自由基的能力顯著高于葉子。上述結(jié)論與黃一泓等[29]研究藏紅花的結(jié)果相似，但在相同的質(zhì)量濃度下，枝干部分的EAE和NBE清除DPPH自由基能力遠高于藏紅花萃取物。

2.4 啤酒花枝葉提取物在β-胡蘿卜素-亞油酸乳化體系中總抗氧化能力的比較

圖4 各樣品在β-胡蘿卜素-亞油酸乳化體系中的抗氧化能力Fig. 4 Total antioxidant activity in β-carotene-linoleic acid model

由圖4可知，各樣品均有一定的抗氧化能力，當質(zhì)量濃度為0～3 mg/mL時，AAI值迅速增大，繼續(xù)增大質(zhì)量濃度，AAI值逐漸趨于平緩。樣品總抗氧化能力依次為EAE＞NBE＞CE＞W(wǎng)E，略小于BHT（IC50值為3.82×10-3mg/mL）。

表6 β-胡蘿卜素-亞油酸體系中各樣品IC50值Table 6 IC50 for total antioxidant activity in β-carotene-linoleic acid model

由表6的IC50值可知，枝干中札一各極性部位的抗氧化活性略高于馬可波羅，葉子中則相反；而札一和馬可波羅兩個品種枝干部分的抗氧化活性區(qū)別不大。祁英等[30]對新疆紫草不同極性部位總抗氧化活性的研究顯示，當樣品質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，EAE和NBE部位的AAI值分別為98%、28%，此結(jié)論與本實驗中EAE的總抗氧化活性接近，但NBE的活性遠小于本實驗的啤酒花枝葉提取物。

2.5 啤酒花枝葉提取物在磷鉬酸體系中總抗氧化能力的比較

圖5 各樣品在磷鉬酸體系中的抗氧化能力Fig. 5 Total antioxidant activity in phosphomolybdenum model

由圖5可知，各樣品抗氧化的AA值隨樣品質(zhì)量濃度的增大而增大，表現(xiàn)出質(zhì)量濃度依賴性。樣品主枝和葉子中各部位的抗氧化能力以EAE最強，其次是NBE、CE和WE；側(cè)枝中各部位的抗氧化能力依次為EAE、CE、NBE和WE。

表7 磷鉬酸體系中各樣品IC50值Table 7 IC50 in phosphomolybdenum model

由表7可知，磷鉬酸體系中樣品抗氧化能力與β-胡蘿卜素-亞油酸乳化體系的結(jié)果類似，枝干中札一各極性部位的抗氧化活性高于馬可波羅，而葉子中相反，且不同極性部位存在顯著差異（P＜0.05）。

由表4～7的數(shù)據(jù)可知，所有抗氧化體系中，EAE的抗氧化能力均高于EE，與黃酮、多酚含量的研究結(jié)果一致，說明多酚、黃酮為其主要的抗氧化活性成分。啤酒花枝葉提取物在β-胡蘿卜素-亞油酸體系的IC50最小，在0.04～0.32 mg/mL之間，磷鉬酸體系最大，達到20.24～143.23 mg/mL。

2.6 啤酒花枝葉不同極性部位多酚、黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析

大量研究表明，植物活性成分的抗氧化能力可能與其多酚、黃酮的含量有關(guān)[18]。為了進一步研究上述提取物的抗氧化活性與多酚、黃酮含量的相關(guān)性，對不同極性部位抗氧化的IC50值與多酚、黃酮含量進行統(tǒng)計分析，4 種抗氧化體系與啤酒花主枝、側(cè)枝和葉子中的多酚、黃酮含量的相關(guān)性分析見表8。

多酚和黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性差異較大。在枝干中，多酚和黃酮含量與抗氧化能力均為極顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)在-0.652～-0.917之間（P＜0.01），在葉子提取物中，除多酚含量與?OH清除能力的相關(guān)系數(shù)為-0.493（顯著相關(guān)（P＜0.05）），在其他抗氧化體系中均為極顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)在-0.728～-0.934（P＜0.01）之間，說明啤酒花枝葉樣品中的多酚、黃酮為其主要抗氧化成分。多酚和黃酮結(jié)構(gòu)中的鄰位酚羥基很容易被氧化成醌類結(jié)構(gòu)，使得多酚和黃酮具有較強捕捉自由基的能力和抗氧化活性，并且抗氧化活性強弱與其多酚和黃酮類物質(zhì)含量的高低、種類、結(jié)構(gòu)有關(guān)，這也說明啤酒花枝葉提取物中多酚、黃酮的種類多樣。

3 結(jié) 論

札一和馬可波羅啤酒花枝葉提取物中含有多酚、黃酮類化合物，且具有一定的抗氧化能力。因多酚、黃酮類化合物種類多，極性范圍較寬，而經(jīng)不同溶劑萃取后，EAE的多酚、黃酮含量和抗氧化活性均高于EE，說明啤酒花枝葉提取物主要以極性較低的黃酮苷元類物質(zhì)為主，經(jīng)過初步分離后，乙酸乙酯對這些成分有效富集。相關(guān)性分析也表明，除個別樣品外，所有抗氧化活性體系與多酚、黃酮含量的相關(guān)系數(shù)絕對值均大于0.650，說明多酚和黃酮是啤酒花枝葉抗氧化作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。而對于啤酒花枝葉的抗氧化成分及其活性的構(gòu)效關(guān)系還有待進一步深入探明。

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