葛 斌，石 燕，王露娟（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖中心，貴州遵義563000）

雄性生殖系統(tǒng)損害導(dǎo)致的不育癥已普遍受到國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注[1]。精核蛋白（TNBP）是一種與雄性生育能力密切相關(guān)的堿性蛋白質(zhì)，大鼠精核蛋白（RP）含量在反映精子質(zhì)量方面有著重要意義[2]。淫羊藿苷（ICA）作為一種傳統(tǒng)中藥，可以抑制生精細(xì)胞凋亡、促進(jìn)睪酮分泌并提高陰莖海綿體鳥苷環(huán)磷酸（cGMP）水平。本研究通過觀察不同劑量ICA對大鼠精子質(zhì)量和TNBP表達(dá)的影響，探索ICA在治療不育癥中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠80只，體重210～235 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院動物中心提供。合格證編號：20150017，飼養(yǎng)于遵義醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，溫度：25℃，濕度：50%。

1.1.2 實驗試劑 腺嘌呤由上海遠(yuǎn)幕生物科技有限公司提供；ICA由南京澤朗生物有限公司提供，純度大于或等于98%。

1.1.3 分組 將80只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、ICA低劑量組、ICA高劑量組，每組20只。

1.2 方法

1.2.1 建立模型 對照組：蒸餾水3 mL灌胃60 d；模型組：腺嘌呤25 mg/100 g和用蒸餾水3 mL配置后灌胃30 d，再以蒸餾水3 mL灌胃30 d；ICA低劑量組：先用腺嘌呤25 mg/100 g和蒸餾水3 mL配置后灌胃30 d，再以ICA 1.8 g/kg和蒸餾水3 mL配置后灌胃30 d；ICA高劑量組：先用腺嘌呤25 mg/100 g和蒸餾水3mL配置后灌胃30d，再以ICA3.6g/kg和蒸餾水3 mL配置后灌胃30 d。

1.2.2 附睪精液采集和測定 按照文獻(xiàn)[3]方法處死大鼠、采集精液，在37℃恒溫水浴箱液化10 min后置于精子全自動分析儀上測定。

1.2.3 精子堿性蛋白提取及電泳 按照文獻(xiàn)[2]方法提取堿性蛋白，在酸性-尿酸系統(tǒng)中進(jìn)行電泳分析，結(jié)果掃描測量條帶數(shù)值，總堿性蛋白（TH）/RP比值代表TNBP相應(yīng)含量。

1.2.4 觀察指標(biāo) 精子密度：每毫升精液的精子數(shù)；精子活率：活動精子/精子總數(shù)；精子活力：前向運動精子數(shù)/精子總數(shù)；TNBP相應(yīng)含量：TH/RP。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠精子質(zhì)量比較 模型組、ICA低劑量、ICA高劑量組精子密度、活率和活力均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；ICA低劑量組大鼠精子密度和活力與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；ICA高劑量組活率和活力均顯著高于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），精子密度與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠精子質(zhì)量比較（±s）

表1 各組大鼠精子質(zhì)量比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別對照組模型組ICA低劑量組ICA高劑量組活力（%）38.22±5.66 16.04±4.16a 18.40±7.74a 26.65±5.52ab密度（×106mL-1）38.53±3.77 12.98±4.16a 14.71±6.10a 14.64±6.65a活率（%）53.57±5.83 22.74±6.11a 27.32±6.63a 38.73±7.37ab

2.2 各組大鼠TNBP含量比較 模型組和ICA低劑量組、ICA高劑量組TH、TH/RP值均顯著高于對照組，RP值顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；ICA高劑量組TH、TH/RP值均顯著低于模型組，RP值顯著高于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠TNBP含量比較（x±s）

3 討 論

目前，男性不育患者發(fā)病率呈上升趨勢，近20年來，人類精子數(shù)量平均每年以2%的速度下降。不育不僅影響患者的身心健康，而且還會帶來一些社會問題，因此，男性不育癥的研究已經(jīng)引起全世界的高度重視。

腺嘌呤可損傷睪丸組織、曲精小管，并導(dǎo)致生精細(xì)胞和TNBP數(shù)量減少、變性，常用于構(gòu)建睪丸損傷大鼠模型[3]。本實驗發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤大鼠模型無論是精子密度、活力、活率和TNBP均顯著低于對照組，說明模型建立比較成功。

TNBP又稱魚精蛋白，是在晚期精子細(xì)胞中出現(xiàn)的一類富含精氨酸和半胱氨酸的堿性蛋白質(zhì)。根據(jù)氨基酸的組成序列可分為兩類，一類是P1TNBP，存在于所有哺乳動物精子細(xì)胞中；另一類為P2TNBP，只存在于人類及很少一部分哺乳動物中。TNBP主要功能是濃縮精子細(xì)胞核，保護(hù)DNA的遺傳信息。

近年研究發(fā)現(xiàn)，精子細(xì)胞內(nèi)組蛋白-精核蛋白反應(yīng)（HPRR）和TNBP的數(shù)量與生育能力有密切關(guān)系[4-5]。哺乳動物精子從精原細(xì)胞發(fā)育為成熟精子的過程中，精子細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合體細(xì)胞類型組蛋白，逐漸被TNBP取代，這個過程稱HPRR，通過HPRR，最終成為高濃度的精子特異性染色質(zhì)。成熟精子內(nèi)的堿性核蛋白主要為TNBP[6]。WU等[7]研究發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)素依賴蛋白激酶4（Camk4）的信使作用與TNBP的轉(zhuǎn)化有關(guān)。1976年，SILVESTRONI等[8]首次報道15例少精子癥不育患者的成熟精子缺乏TNBP成分，認(rèn)為這是導(dǎo)致原發(fā)性不育癥的原因之一。CARRELL等[9]的研究也發(fā)現(xiàn)，P2精核蛋白異常與生育力減退有關(guān)。DE YEBRA等[10]報道，116例男性少弱精癥患者TNBP異常率為77.5%，且有些患者P2 TNBP完全缺失。陳暉等[11]對1 050例少弱精癥患者TNBP分析提示，異常率為81.05%，認(rèn)為男性TNBP指標(biāo)可供臨床評價精子受孕能力。費江楓等[12]研究發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤誘導(dǎo)的不育大鼠精子中TNBP及其mRNA含量明顯低于正常組。

ICA為淫羊藿的干燥莖葉提取物，是淫羊藿的主要有效成分之一。研究表明，ICA在心腦血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和腫瘤中具有重要的藥理作用。李波等[13]發(fā)現(xiàn)，ICA可使動物睪酮水平升高，并調(diào)控下丘腦CHR和垂體POMC基因的表達(dá)水平，說明ICA對生殖系統(tǒng)的影響主要在下丘腦和垂體組織。高學(xué)勇等[14]研究發(fā)現(xiàn)，ICA能促進(jìn)幼年小鼠附睪及精囊的發(fā)育。覃光輝等[15]研究發(fā)現(xiàn)，ICA能明顯改善雷公藤多苷對小鼠睪丸的病理損傷，與模型組相比，治療組小鼠睪丸生精管管壁較厚，細(xì)胞層次較寬，細(xì)胞增殖旺盛。高孟婷等[16]應(yīng)用125I放射免疫法測定不同濃度ICA對家兔陰莖海綿體內(nèi)PDE5酶底物cGMP水平的影響。結(jié)果顯示，ICA能提高陰莖海綿體內(nèi)cGMP水平。蔣兆健等[17]也采用125I放射免疫法觀察ICA對家兔陰莖海綿體平滑肌組織中cGMP水平的影響，結(jié)果顯示，ICA能直接升高cGMP水平。鐘瑜等[18]制備腎陽虛細(xì)胞模型，觀察ICA干預(yù)后糖皮質(zhì)激素受體（GR）的mRNA和蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，經(jīng)ICA干預(yù)后的GR mRNA和蛋白表達(dá)均明顯增加。表明ICA對內(nèi)分泌系統(tǒng)的作用明顯。另外，ICA對性腺還有較大的影響作用。趙翌等[19]通過在獲能液mTBM+肝素中添加ICA，利用金霉素?zé)晒馊旧ńY(jié)合體外受精試驗，觀察新鮮豬精子的體外獲能效果，結(jié)果表明，ICA能夠顯著促進(jìn)豬精子體外獲能效果。

本研究發(fā)現(xiàn)，ICA高劑量組能顯著提高模型大鼠的精子活率、活力、RP值，說明ICA可促進(jìn)精子獲能、提高TNBP含量；但是本研究也發(fā)現(xiàn)，ICA不能提高精子密度，而且ICA高劑量組雖然可以有效改善大鼠精子的活率、活力和TNBP含量，但仍然低于對照組。分析原因可能與用藥時間短和樣本量少有關(guān)，下一步擬擴(kuò)大樣本量、進(jìn)一步延長用藥時間進(jìn)行研究。

綜上所述，ICA作為一種傳統(tǒng)中藥，可通過提高RP值和精子活率來有效改善雄性生殖功能。

[1]李俊濤，曲曉偉，張蜀武，等.益腎生精膠囊對鄰苯二甲酸二丁酯致生殖功能損傷大鼠精子質(zhì)量及生殖激素水平的影響[J].中華男科學(xué)雜志，2016，22（12）：1110-1115.

[2]葛斌，楊智敏，路健，等.重度畸形精子癥患者精核蛋白表達(dá)的研究[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2015，31（6）：818-819.

[3]王旭初，潘天明.四子種王膠囊治療雄性不育大鼠實驗研究[J].河北中醫(yī)，2011，33（2）：269-271.

[4]潘天明.少弱精癥與精核蛋白的關(guān)系研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，19（33）：4358-4360.

[5]OLIVA R，DIXON GH.Vertebrate protamine genes and the histone-toprotamine replacement reaction[J].Prog Nucleic Acid Res Mol Biol，1991，40：25-94.

[6]王旭初.男性不育與精核蛋白的關(guān)系及中西醫(yī)治療進(jìn)展[J].光明中醫(yī)，2012，27（12）：2614-2616.

[7]WU JY，RIBAR TJ，CUMMINGS DE，et al.Spermiogenesis and exchange of basic nuclear proteins are impaired in male germ cells lacking Camk4[J].Nat G enet，2000，25（4）：448-452.

[8]SILVESTRONI L，F(xiàn)RAJESE G，F(xiàn)ABRIZIO M.Histones instead of protamines in terminal germ cells of infertile，oligospermic men[J].Fertil Steril，1976，27（12）：1428-1437.

[9]CARRELL DT，LIU L.Heparin binding sites are present at a higher concentration on sperm of subfertile men than donors of known fertility[J].Arch Androl，2002，48（2）：147-154.

[10]DE YEBRA L，BALLESCà JL，VANRELL JA，et al.Complete selective absence of protamine in humans[J].J Bio Chem，1993，268（14）：10553-10557.

[11]陳暉，陳松，費江楓，等.1050例不育男性精子堿性核蛋白的分析[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2005，14（3）：135-138.

[12]費江楓，李海松，陳暉.腺嘌呤誘導(dǎo)不育大鼠精子中精蛋白mRNA的研究[J].生殖與避孕，2003，23（2）：65-68.

[13]李波，安睿，王新宏，等.淫羊藿苷和補(bǔ)腎復(fù)方對腎陽虛大鼠下丘腦CRH基因和垂體POMC基因表達(dá)的影響[J].中成藥，2008，30（1）：132-134.

[14]高學(xué)勇，王瑋.淫羊藿苷對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)生精障礙大鼠睪丸的影響[J].中外醫(yī)療，2009，28（17）：19.

[15]覃光輝，姚重華，王驍，等.不同劑量淫羊藿苷對雷公藤多苷模型小鼠睪丸病理損傷的影響[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2014，12（2）：156-158.

[16]高孟婷，馬芳芳，吳少輝，等.淫羊藿苷的藥理作用研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（18）：9623-9625.

[17]蔣兆健，胡本容，付琴，等.淫羊藿苷對家兔陰莖海綿體環(huán)核苷酸水平的影響[J].華中科技大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2007，36（2）：166-168.

[18]鐘瑜，李曉清，徐曉玉，等.淫羊藿苷對腎陽虛細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)影響的研究[J].中國藥房，2007，18（36）：2801-2803.

[19]趙翌，徐捷，相榮科，等.β-谷甾醇、淫羊藿苷對豬精子體外獲能效果的影響[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2010，30（7）：996-999.