闕 州， 隋正紅， 米 萍， 商二磊

(中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，山東 青島266003)

在淡水中，已發(fā)現有大量寄生于藻類中的游孢子型真菌(zoosporic true fungi)，包括壺菌門(Chytridiomycota)，新美鞭菌門(Neocallimastigomycota)和Blastocladiomycota，此外還有許多類似真菌的生物被發(fā)現寄生在微藻中，包括卵菌(Oomycetes)、擬網黏菌類(Labyrinthulids)、破囊壺菌類(Thraustochytrids)等[1]。然而寄生于海洋藻類的真菌至今了解甚少。藻類養(yǎng)殖業(yè)中由寄生生物引起的疾病會造成大量的經濟損失，在所有寄生生物(原生動物、假菌界、真菌、細菌、寄生藻類、線蟲和病毒)中，真菌所造成的影響僅次于細菌[2-3]。關于藻類寄生真菌的研究主要集中在致病真菌方面，真菌感染特異性和菌藻關系是菌藻作用的研究重點[4-5]，而真菌的致病機理和生理反應相關研究則很少涉及，這也是未來研究藻類致病真菌的主要目標和方向。

海洋藻類寄生致病真菌主要有三個綱：壺菌綱(Chytridiomycetes)、子囊菌綱(Ascomycetes)和半知菌綱(Deuteromycetes)[6-7]，已被鑒定的物種包括6種壺菌、31種子囊菌和1種半知菌[5]。6種壺菌為Chytridiumpolysiphoniae，Chytridiummegastomum，Coenomycessp.，Rhizophydiumlittoreum，Olpidiumrostriferum和Thalassochytriumgracilariopsidis。最初的研究表明，Chytridiumpolysiphoniae是一種寄生病原菌，可使紅藻Centrocerasclavulatum(C. Agardh)及褐藻Sphacelariasp.和Pylaiellalittoralis致病[3,8]。進一步的研究還發(fā)現，Chytridium能夠侵染23種褐藻，包括8個目，19個屬[9]。Chytridium引起最嚴重的病害會導致黑頂藻(Sphacelaria)種群消失[3]。Coenomycessp.是一種侵染綠藻Cladophorasp.的寄生菌，然而被侵染的藻體形態(tài)不發(fā)生改變[10]。Olpidiumrostriferum是一種內共生壺菌可侵染綠藻Cladophora和Rhizoclonium[3,11]，被侵染的藻體出現細胞腫大、偏褐色的癥狀[12]。Thalassochytriumgracilariopsidis首次被發(fā)現于龍須菜(Gracilariopsislemaneiformis)中，且是一種龍須菜高度特異的寄生菌，只侵染來自中國青島的龍須菜，對智利江蘺(Gracilariachilensis)、細枝江蘺(Gracilariatenuistipitata)等其它江蘺物種，甚至美國的龍須菜均沒有侵染性，且對寄主無害處[13]。

本研究發(fā)現1種龍須菜寄生真菌?；趎ucSSU rDNA和nucLSU rDNA的部分序列分析方法建立的系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示，該真菌屬于壺菌門(Chytridiomycota)，壺菌綱(Chytridiomycetes)，Lobulomycetales目；基于ITS1-5.8S-ITS2序列分析方法建立的系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示，該真菌不歸屬于Lobulomycetales目內任一已知屬，可能是Lobulomycetales目內1個新的屬。是首次發(fā)現寄生于紅藻江蘺的Lobulomycetales目物種。為了研究寄生真菌對龍須菜生長發(fā)育產生的影響，我們通過切片結合顯微觀察方法研究真菌侵染龍須菜的整個過程，結果表明真菌會損害龍須菜生長發(fā)育，會導致龍須菜細胞出現變形、脫色等癥狀，嚴重可致龍須菜藻體斷裂。通過PAS、CBB和Nile-red 3種方法染色發(fā)現，真菌富含多糖和蛋白質，不含(或少含)脂質；3種染色均可作為判斷藻體是否含真菌的方法。本研究為深入闡明菌藻作用提供了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料準備

通過切片觀察選取含有錐狀/管狀特殊結構(真菌孢子囊)和菌絲體的龍須菜藻體若干株(見圖1)，去除藻體表面雜質及附生物，單獨培養(yǎng)，實驗室培養(yǎng)條件為22 ℃, 15 μmol·m-2·s-1, 鹽度30‰, 12 h：12h 光暗周期。

( a.龍須菜體內含真菌孢子囊(箭頭)；b.龍須菜體內含真菌菌絲體(箭頭)。a. The sporangium of the fungus(black arrow)；b. The hypha of the fungus(black arrows).)

圖1 帶真菌的龍須菜藻體
Fig.1 The frond ofGp.lemaneiformiscontains endosymbiotic fungi

1.2 序列擴增和測序

參照Timothy等[14]CTAB法提取龍須菜基因組DNA。

由于該真菌游孢子含有單鞭毛的特征，所以初步鑒定其屬于壺菌門，選取壺菌門4個目共10個物種的18S和28S rDNA序列進行ClustalX比對，在 18S rDNA 3’側和28S rDNA 5’側各找到一段同源性高的序列，運用Primer5.0分別于兩段高同源性序列中設計出大小均為23 bp的上游和下游PCR引物，引物序列如下：

正向引物：5′ CGCTA(C/G)TACCGATTGAATGGCTT 3′；

反向引物：5′ TCTTTCCCTCACGGTACTTGTTC 3′。

以提取的基因組DNA為模板，利用上述引物進行PCR擴增，PCR程序為：94 ℃ 5.0 min；94 ℃ 1.0 min，54、56、59、62、65 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1.0 min，30 個循環(huán)；72 ℃10.0 min。擴增產物直接進行PCR產物測序，測序由青島擎科公司負責完成。測序采用Sanger雙向測序方法，測序完成后，運用ContigExpress軟件對測序結果進行拼接。

1.3 重建系統(tǒng)發(fā)育進化樹

目標序列拼接完成后，與NCBI數據庫比對，選取目標序列的18S和28S部分。再用18S+28S序列與NCBI數據庫比對，找出與目標序列的18S+28S同源性較高的門類，下載該門類中所有綱、所有目、所有科、所有屬的物種的18S+28S序列(如果有的話)。運用ClustalX軟件進行序列比對，比對后的序列采用MEGA軟件Kimura-2模型構建ML和NJ進化樹。18S+28S序列建樹可將目標真菌鑒定到屬。

根據18S+28S序列的建樹結果，下載與目標真菌進化關系最密切的目中所有種的ITS1-5.8S-ITS2序列，運用與上述同樣的方法建樹。ITS1-5.8S-ITS2序列建樹可將目標真菌鑒定到種。

1.4 龍須菜寄生真菌侵染過程的觀察

選取帶真菌的龍須菜藻體，利用徒手切片方法對帶真菌藻體進行連續(xù)切片觀察。顯微觀察采用 NIKON Eclipse 80i 顯微鏡。

1.5 龍須菜寄生真菌的染色觀察

為了觀察藻體內部的真菌菌絲，以及判斷菌絲和孢子囊的化學組分，我們采用希夫氏高碘酸(PAS)、考馬斯亮藍(CBB)和尼羅紅(Nile red)方法對其進行染色觀察[15-17]。PAS染色多糖為紅色，CBB染色蛋白質為深藍色，尼羅紅可與脂質物質結合，結合后在紫外光激發(fā)下顯示紅色。

2 結果

2.1 序列擴增和測序

PCR結果顯示5個退火溫度都擴增出一個較亮的單一條帶，條帶大小為 1 100 bp左右，說明擴增條帶特異性強。擴增產物經測序和拼接獲得1 045 bp的目標序列，該序列已提交NCBI，序列編號為KU869767。

2.2 建立系統(tǒng)發(fā)育進化樹

用目標序列的18S+28S與NCBI數據庫比對，結果顯示與該真菌同源性較高的物種都屬于壺菌門(Chytridiomycota)，根據該真菌具有單鞭毛的特性，也能判定其屬于壺菌門。因此我們選取壺菌門中所有含18S+28S序列的屬，下載其18S+28S序列。選取物種包括壺菌門2個綱，8個目，16個科，22個屬，23個物種；同是真菌界的Mucoromycota門3個物種；以及2個outgroup物種。構建ML樹(見圖2)。結果顯示，龍須菜寄生真菌(Aim)屬于Lobulomycetales目，是Lobulomycetales目中起源較早的物種，且不歸屬于任一已知屬，可能是Lobulomycetales目一個新的屬。

為了進一步研究該真菌的種的界定，我們選取并下載Lobulomycetales目中所有物種的ITS1-5.8S-ITS2序列。選取的物種包括1個科，4個屬，8個種，以及2個未確定屬的物種(AF011和AF017)；Lobulomycetales目2個物種；以及blastocladiomycota門的2個物種作為outgroup。構建ML樹(見圖3)。結果顯示，目標真菌(Aim)與2個未確定屬(AF011、AF017)的物種進化關系最密切，是Lobulomycetales目中起源較早的物種，且不歸屬于任一已知屬，可能是Lobulomycetales目內一個新的屬。

NJ樹形與ML樹形一致。

圖2 基于18S+28S部分序列建立的ML進化樹(Aim為(目標真菌))Fig.2 ML phylogenetic tree based on partial 18S+28S sequence (Aim is the purpose fungus)

圖3 基于ITS1-5.8S-ITS2序列建立的ML樹Aim為(目標真菌)Fig.3 ML phylogenetic tree based on ITS1-5.8S-ITS2 sequence(Aim is the purpose fungus)

2.3 龍須菜附生真菌侵染過程的觀察

通過切片觀察，我們研究了真菌侵染龍須菜過程。真菌首先侵入龍須菜表面膠質層，侵染處形成漏斗狀痕跡(見圖3 a)，然后菌絲通過表皮細胞間隙進入到髓部(見圖3 b)，并在髓部產生孢子囊(見圖3 c)，孢子囊產生大量游動孢子，整個孢子囊呈黃色(見圖3 d)，孢子囊發(fā)育成熟后開始放散游孢子(見圖3 e)，放散完后孢子囊顏色變淺(見圖3 f)，此時龍須菜表面出現大量孔洞(見圖3 g)，內部細胞形狀異常甚至破裂(見圖3 h)，嚴重時藻體出現斷枝。

2.4 龍須菜寄生真菌的染色觀察

龍須菜寄生真菌菌絲伸入到次表皮細胞和髓部細胞中，孢子囊也嵌入藻體內部細胞間。孢子囊較大淺黃或黃色容易觀察(見圖4 a)，而菌絲較細，顏色與髓部細胞一樣都偏白色(見圖4 g. 箭頭)，不易觀察。3種染色方法的染色結果顯示，真菌的孢子囊可以被PAS和CBB染色(見圖4 b、c)，菌絲也可以被PAS和CBB染色(見圖4 e、f. 箭頭)，表明真菌的孢子囊和菌絲都富含多糖和蛋白質。Nile red對菌絲和孢子囊染色后，于紫外光激發(fā)下并不顯示紅色，而是顯示藍色(見圖4 h. 綠色箭頭)，表明真菌孢子囊和菌絲不含脂質，而可能含多酚，因為多酚物質能在紫外光激發(fā)下發(fā)藍光。菌絲被PAS、CBB和Nile red染色后顏色(或熒光)較深，明顯與髓部細胞區(qū)別開來。當真菌侵染龍須菜前期孢子囊并沒有形成時，只有菌絲存在于藻體內部，菌絲顏色淺(見圖4 g. 紅色箭頭)，較難發(fā)現，運用這些染色方法即可有效判斷藻體是否含真菌菌絲(見圖4 h. 紅色箭頭)。

3 討論

壺菌門(Chytridiomycota)是游孢子具有一根后生尾鞭式鞭毛，鞭毛具有“9+2”結構的一類真菌。壺菌門的鞭毛結構也是其區(qū)別于真菌其它門類的主要依據。多數水生，少數兩棲或陸生，腐生、寄生、專性寄生均有。Rhizophydium是壺菌門最早被報道的種類，Schenk(1858)把Rhizophydium納入Chytridiales目[18]。過去分類學家根據菌絲形態(tài)、對稱中心、孢子囊蓋、隔膜等形態(tài)特征把壺菌門分為1個綱：Chytridiomycetes，3個目：Chytridiales，Blastocladiales，Monoblepharidales[19]。然而，壺菌門的物種形態(tài)差異較大，隨著越來越多壺菌門的物種被鑒定出來，形態(tài)的多樣性也越來越大，甚至同一屬的物種形態(tài)特征都很難統(tǒng)一，沒有一個統(tǒng)一的分類標準[20]，而且還有報道稱即便是同一物種，不同培養(yǎng)環(huán)境下其形態(tài)也會發(fā)生變化[21]。1980年，Barr 用游孢子亞細胞顯微觀察方法把Spizellomycetales從Chytridiales中分離出來成立一個新的目[22]，20年后，分子生物學手段的應用支持了游孢子亞細胞結構分析的合理性[23]。近年來綜合運用分子生物學和亞顯微技術極大推動了壺菌門系統(tǒng)分類研究[14, 23-25]，研究發(fā)現Spizellomycetales和Chytridiales目不是單系群。2006年，Letcher等通過對SSU和LSU rDNA序列分析和游孢子亞細胞結構觀察方法，把Rhizophydium分枝從Chytridiales中分離出來單獨成立一個新的目Rhizophydiales[26]。而后研究者又從Spizellomycetales分出來一個新的目Rhizophlyctidales[25]。Sharon等[27]同樣通過對SSU 和 LSU rDNA序列分析和游孢子亞細胞結構觀察方法，把Cladochytrium進化枝從Chytridiales中分離出來單獨成立一個新的目Cladochytriales。Simmons等[28]利用同樣的方法，把Chytridiales的一個分支C.angularis分離出來另立一個新目Lobulomycetales。Longcore等[29]把Polychytrium提升為新的目Polychytriales。Karpov等[30]同樣通過亞顯微觀察和rDNA序列分析方法發(fā)現了兩個新的目：Gromochytriales和Mesochytriales。此外，分類學家Hibbett等[31]通過進一步分析把原屬Chytridiomycetes綱的Monoblepharidales目提升為一個新的綱Monoblepharidomycetes；James等[14]把原屬壺菌門的Blastocladiales上升為Blastocladiomycota門。所有這些新目的發(fā)現不但反映了壺菌門種類的豐富多樣性，而且建立了以分子生物學手段為主的壺菌門分類標準[29]。通過亞顯微觀察和基因序列分析方法在壺菌門分類鑒定中的應用，截至目前，壺菌門分為2個綱和10個目，2個綱分別為Chytridiomycetes和Monoblepharidomycetes，Monoblepharidomycetes有1個目Monoblepharidales，Chytridiomycetes有9個目為：Chytridiales、Spizellomycetales、Rhizophydiales、Rhizophlyctidales、Cladochytriales、Lobulomycetales、Polychytriales、Gromochytriales、Mesochytriales。

(a.真菌首先侵入龍須菜表面膠質層，侵染處形成漏斗狀痕跡(箭頭)，b.然后菌絲通過表皮細胞間隙(箭頭)進入到髓部細胞，并在髓部細胞產生孢子囊(c. 箭頭)，孢子囊產生大量游動孢子，整個孢子囊呈黃色(d)，孢子囊發(fā)育到一定程度后開始放散游孢子(e. 箭頭)，游孢子放散完后孢子囊顏色變淺(f)，此時龍須菜表面出現大量孔洞(g)，內部細胞形狀異常甚至破裂(h. 箭頭)。Firstly, the fungi entered into the surface ofGp.lemaneiformisto form a funnel-shaped structure (a). The hypha extended through the intercellular space to reach the medullary cell layer (b). The sporangium was produced by the inner part of the hypha (c) and it developed fast through zoospores mitosis (d). Later, the zoospores were released (e) and the color of sporangium turned to pale yellow (f). Meanwhile, for the algae, there were lots of holes in the surface (g) and the inner cells turnedmorphologically abnormal and evenly died (h).)

圖4 龍須菜寄生真菌侵染過程
Fig.4 The endosymbiotic fungal infection process inGp.lemaneiformis

(a.真菌孢子囊；b.PAS染色孢子囊；c.CBB染色孢子囊；d.菌絲(箭頭)；e.PAS染色菌絲(箭頭)；f.CBB染色菌絲(箭頭)；g.孢子囊菌絲(紅色箭頭)和孢子囊(綠色箭頭)；h.Nile red染色后菌絲(紅色箭頭)和孢子囊(綠色箭頭)紫外光觀察。 a.the sporangium; b. the sporangium stained by PAS; c. the sporangium stained by CBB;d. the hypha (black arrow);e. the hypha stained by PAS. f. the hypha stained by CBB;g. the hypha (red arrow) and sporangium (green arrow) before stained by Nile red; h. the hypha (red arrow) and sporangium (green arrow) under the UV-light after stained by Nile red.)

圖5 PAS、CBB和Nile red染色孢子囊和菌絲
Fig.5 The sporangium and the hypha stained by PAS, CBB and Nile red

本研究發(fā)現一種龍須菜寄生真菌，利用nucSSU rDNA和nucLSU rDNA的部分序列建立的系統(tǒng)發(fā)育進化樹表明該真菌屬于壺菌門(Chytridiomycota)，壺菌綱(Chytridiomycetes)，Lobulomycetales目；利用ITS1-5.8S-ITS2序列建立的系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示，該真菌不歸屬于Lobulomycetales目內任一已知屬，可能是Lobulomycetales目內一個新的屬。關于Lobulomycetales目的分類依據和基本特征研究Simmons等(2009)已經對其進行了概括[28]。Lobulomycetales目包含4個屬：Lobulomyces、Clydaea、Maunachytrium、Alogomyces。Lobulomycetales目的物種存在于土壤、淡水和海洋環(huán)境中，甚至于馬糞中也有出現[32-35]。其中，ChytridiumpolysiphoniaeCohn是由Cohn 于1865年發(fā)現并命名的寄生于多管藻Polysiphoniaviolacea的真菌[36]，此后Feldmann[10]和 Sparrow[37]把該菌歸屬于壺菌目(Chytridiales)壺菌科(Chytridiaceae)，但缺乏分子系統(tǒng)進化分析。Simmons等[28]通過rDNA序列分析和游孢子亞細胞結構分析發(fā)現Chytridiumpolysiphoniae屬于Lobulomycetales目，這是第一個被發(fā)現存在于藻類體內的Lobulomycetales目的物種，Kupper等[35]的研究還發(fā)現ChytridiumpolysiphoniaeCohn寄生在褐藻中。而本實驗研究的龍須菜共生菌則是第二個被發(fā)現存在于藻類體內的Lobulomycetales目的物種，因此進一步增加了藻類共生壺菌的認識。

本研究通過切片染色研究真菌的化學組分，運用PAS、CBB和Nile-red 3種方法染色發(fā)現，真菌富含多糖和蛋白質，不含(或少含)脂質。當真菌侵染龍須菜前期孢子囊并沒有形成時，只有菌絲存在于藻體內部，菌絲顏色淺，較難發(fā)現，運用這3種染色方法均可判斷藻體是否含真菌。同時，通過切片觀察初步研究了真菌侵染龍須菜的過程。發(fā)現真菌侵染的前期(游孢子放散前)，藻體內部細胞和表面形態(tài)都無明顯異常，藻體生長狀態(tài)良好；真菌侵染的后期(游孢子放散后)，藻體內部細胞肥大、褪色，藻體表面出現大量孔洞，嚴重時藻體出現斷裂。表明該真菌的侵染會導致龍須菜致病，該真菌對龍須菜的生長發(fā)育有害。與本研究不同的是，Nyvall等[13]研究表明Thalassochytriumgracilariopsidis對龍須菜不產生有害影響，而本研究分離的真菌對藻體有明顯的破壞作用，這豐富了對龍須菜寄生真菌及其影響的認識。同時，龍須菜作為一種重要的經濟海藻，其有害寄生真菌的發(fā)現將會引起學界對藻類有害菌的更多關注。過去有學者初步從生理角度研究寄生真菌對藻類的影響，Gachon等[38]通過測定Chytridiumpolysiphoniae侵染褐藻前后的葉綠素熒光曲線，發(fā)現Chytridiumpolysiphoniae影響寄主褐藻光合作用速率。Thalassochytriumgracilariopsidis侵染龍須菜后，龍須菜體內的α-1,4-葡聚糖裂解酶活性明顯升高[13]。而鹽度是寄生菌Olpidiumrostriferum和Coenomycessp.生長的主要影響因子，Raghukumar[12]報道Olpidiumrostriferum和Coenomycessp.在7—9月的時候生物量最大，這段時期是淡水流入海水量最大的時期。進一步從生理和病理的角度研究有害寄生菌的侵染機理及防治措施，將會有效減少藻類栽培中由寄生真菌造成的經濟損失，也是未來藻類寄生菌的研究方向之一。

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