陳澄亮 陳積賢 薛迪新 吳偉力 戴華衛(wèi) 金凱 徐定銀 曹高健 黃振豐 周瑞耀 吳道義 曾鈺

結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多方面、多環(huán)節(jié)綜合調(diào)控的過程，與飲食、體力活動、遺傳易感性等有一定的關(guān)系。結(jié)直腸黏膜細胞從正常向癌演變、從腺瘤發(fā)展為腺癌的過程中發(fā)生了一系列基因的改變，但目前關(guān)于這一系列變化的原因尚未明確。微小RNA（miRNA）是一類長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，普遍存在于動植物和病毒中。miRNA已被發(fā)現(xiàn)在許多腫瘤中表達異常[1－2]。因此，本實驗通過探討 miR－30c－1－3p在人結(jié)直腸癌組織中的表達及臨床意義，為結(jié)直腸癌在分子水平的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 標本來源 實驗標本來自2014年6月至2015年6月在本院行手術(shù)治療的52例結(jié)直腸癌患者，病理診斷均為腺癌，所有患者術(shù)前均未行放化療；其中男30例，女 22 例；年齡 38～86（64.0±14.8）歲；結(jié)直腸癌的分期依據(jù)2015年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）公布的結(jié)直腸癌TNM分期法。采集每例患者經(jīng)手術(shù)切除的癌組織及距離癌組織＞5cm的癌旁正常黏膜組織各1份，液氮速凍后放置－80℃恒溫冰箱中保存，留待提取miR－30c－1－3p。本實驗經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查通過，采集標本前與所有患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 采用Trizol法，Total RNA Exteractor（生工生物工程有限公司）提取總RNA，按照說明書進行操作。提取完成的總RNA通過電泳檢驗，在紫外透射光下觀察拍照。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 利用提取的總RNA，miR－30c－1－3p加特異性引物，用焦碳酸二乙酯（DEPC）處理后的水定容至 13μl，70°C 溫水浴 5min，置于冰上冰浴 10s，離心，加入4.0μl反應(yīng)緩沖液、2.0μl dNTP、1.0μl RNA 酶抑制劑、2.0μl逆轉(zhuǎn)錄酶（濃度為 10U/μl），37°C 溫水浴5min，42°C 溫水浴 60min，70°C 溫水浴 10min；反應(yīng)完成。

1.2.3 實時定量PCR 體系：SG Fast qPCR Master Mix（High Rox）（2X）（生工生物工程有限公司）10μl，正向引物、反向引物各 0.4μl，cDNA 模板 20μl，DEPC 處理后的水7.2μl；各基因的引物序列見表1。循環(huán)條件：初始維持 95℃ 3min；熔解 95℃ 7s，退火 57℃ 10s，延伸 72℃15s，共循環(huán) 40 次。miR－30c－1－3p 使用 U6 作為內(nèi)參，計算機分析Ct值，采用2－ΔΔCt法計算相對表達量，即miR－30c－1－3p 表達水平。

表1 實時定量PCR反應(yīng)引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料不符合正態(tài)分布，故用 M（P25，P75）表示，組間比較采用Wilcoxon符號秩檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織與癌旁正常黏膜組織中miR－30c－1－3p表達水平的比較 結(jié)直腸癌組織中miR－30c－1－3p表達水平為0.627（0.442，0.935），明顯低于癌旁正常黏膜組織的 0.986（0.694，1.328），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。根據(jù)擴增曲線（圖 1），估計 miR－30c－1－3p擴增效率基本一致。根據(jù)熔解曲線（圖2），基本判斷miR－30c－1－3p產(chǎn)物單一，不含引物二聚體等其他非目的性產(chǎn)物，熔解溫度為82.08℃。

圖1 miR-30c-1-3p擴增曲線

圖2 miR-30c-1-3p熔解曲線

2.2 結(jié)直腸癌組織中miR－30c－1－3p表達水平與患者臨床特征的關(guān)系 結(jié)直腸癌組織中miR－30c－1－3p表達水平與患者有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)（均P＜0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期的患者結(jié)直腸癌組織中miR－30c－1－3p表達水平均較低；與患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤位置、分化程度、浸潤深度等均無關(guān)（均 P＞0.05），見表2。

3 討論

在結(jié)直腸腫瘤中，有些基因被認為是導(dǎo)致腫瘤進展的癌基因如K－ras基因，有些被認為是抑癌基因如APC基因；此外，錯配修復(fù)基因的突變、基因過度表達等在腫瘤進展中也起到重要作用。miRNA是近年來作為抑癌基因或原癌基因被報道較多的小分子基因，已發(fā)現(xiàn)其在許多腫瘤組織中表達異常，且參與腫瘤的生長[3]、增殖[4]、侵襲[5]、轉(zhuǎn)移[6]、凋亡等，被認為是治療腫瘤的新靶點[7-8]。

miR-30c是miRNA家族的成員之一。近年來研究表明miR-30c-1-3p通過3′非編碼區(qū)改變靶基因細胞色素p450 3A4，從而使受體不表達[9]。相關(guān)研究報道m(xù)iR-30c在乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤組織中表達升高[10-11]，Huang等[12]研究發(fā)現(xiàn)miR-30c通過靶基因ASF/SF2腫瘤蛋白剪接因子來抑制前列腺癌細胞的存活。Agostini等[13]研究認為miR-30c在卵巢腫瘤組織中表達下調(diào)。Cao等[14]研究發(fā)現(xiàn)miR-30c-5p通過靶點MTA1來抑制胃癌的遷移以及上皮細胞到間葉細胞的轉(zhuǎn)變。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)miR-30a-5p通過調(diào)節(jié)GRP78表達，從而抑制腎細胞癌的生長。Kawaguchi等[16]認為乳腺癌患者生存率的提高與miR-30a的高表達有關(guān)。除了腫瘤學(xué)領(lǐng)域，miR-30c還被發(fā)現(xiàn)能減少高血脂和2型糖尿病小鼠的血漿TC水平[17]。Singh等[18]研究表明恢復(fù)miR-30a的表達，能抑制神經(jīng)母細胞瘤的致瘤性，且有自噬抑制作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-30c-1-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達明顯下調(diào)，與患者有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等有關(guān)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤位置、分化程度、浸潤深度等無關(guān)；這提示miR-30c-1-3p可能與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)。因此，筆者提出大膽假設(shè)：在結(jié)直腸癌的發(fā)生過程中，miR-30c-1-3p表達水平會降低；若能通過方法將miR-30c-1-3p的表達上調(diào)，有望抑制結(jié)直腸癌的進展。

綜上所述，miR-30c-1-3p在人結(jié)直腸癌組織中表達下調(diào)，與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)；提示miR-30c-1-3p可能與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)。

表2 結(jié)直腸癌組織中miR-30c-1-3p表達水平與患者臨床特征的關(guān)系

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