郎志芳 王洪偉 李姝 劉蘭濤

[摘要] 目的 探討絞股藍(lán)總皂苷對糖尿病腎病大鼠皮質(zhì)基因表達(dá)譜的影響。 方法 選取30只大鼠為實驗樣本，制作20只DN模型后分為對照組和觀察組，對照組為DN大鼠參考組，觀察組DN大鼠則應(yīng)用絞股藍(lán)總皂苷進(jìn)行治療，對比兩組DN大鼠腎皮質(zhì)基因表達(dá)譜差異。 結(jié)果 觀察組大鼠與對照組大鼠腎皮質(zhì)基因表達(dá)上存在差異，差異基因132條，其中31條上調(diào)基因，133條下調(diào)基因。 結(jié)論 絞股藍(lán)總皂苷對糖尿病腎病大鼠皮質(zhì)基因表達(dá)譜有明顯影響，可改變其基因表達(dá)，改善其糖尿病癥狀和免疫機(jī)能。

[關(guān)鍵詞] 絞股藍(lán)總皂苷；糖尿病腎??；腎皮質(zhì)基因表達(dá)

[中圖分類號] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1672-4062（2018）11（a）-0169-02

糖尿病腎病是常見的糖尿病并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者晚期常見的致死性并發(fā)癥。截止到目前為止，尚未在研究中明確糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制，通常認(rèn)為與糖代謝異常、高血壓、腎組織血管活性物質(zhì)、機(jī)體生長因子、機(jī)體化學(xué)趨化因子、遺傳等因素有關(guān)。絞股藍(lán)總皂苷是一種提取自葫蘆科植物絞股藍(lán)的活性物質(zhì)，具有良好的抗高血脂、抗動脈中樣硬化、降血糖、抗腫瘤、清除氧自由基等功效，有學(xué)者指出絞股藍(lán)總皂苷可有效降低糖尿病腎病小鼠血糖，改善糖尿病小鼠腎功能，因此為探究絞股藍(lán)總皂苷對DN大鼠腎皮質(zhì)基因表達(dá)譜的影響，展開該次研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 模型鼠制備及分組

共選取30只大鼠進(jìn)行實驗，均為正常環(huán)境下培育。其中20只切除所有大鼠單側(cè)腎后行STZ注射制作改良DN大鼠模型，隨機(jī)分為對照組和觀察組，每組10只。另外10只實驗用大鼠不做特殊處理，作為正常參考組。

對照組10只DN大鼠每日使用0.5 g/kg生理鹽灌胃，觀察組10只DN大鼠每日使用0.5 g/kg絞股藍(lán)總皂苷灌胃，參考組10只正常大鼠每日使用0.5g/kg生理鹽進(jìn)行灌胃，灌胃1次/d，連續(xù)灌胃4周，于4周后對比3組大鼠腎皮質(zhì)基因表達(dá)譜變化。同時納入實驗大鼠均為單籠飼養(yǎng)，進(jìn)水、進(jìn)食為過剩補(bǔ)給，有大鼠自主選擇進(jìn)食和進(jìn)水時機(jī)。

1.2 實驗及標(biāo)記方法

使用“一步法”抽提觀察組大鼠腎皮質(zhì)總RNA，采用Oligotex mRNA Midi Kit純化mRNA，利用反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記cDNA探針并純化。直接標(biāo)記大鼠cDNA，其中對照組大鼠RNA使用Cy3熒光標(biāo)記，觀察組大鼠RNA使用Cy5熒光標(biāo)記。

1.3 雜交與洗滌

基因芯片（來源于上海博興基因芯片有限公司）和雜交探針分別置于95℃水中，水浴5 min使之變性，并將探針加在基因芯片上，蓋玻片封片后將基因芯片置于60℃水中雜交，持續(xù)15～17 h，雜交完成后揭開蓋玻片，并使用2*SSC+02%*SDS、0.1%SSC+0.2%SDS、0.1%SSC洗滌，分別洗滌10 min，室溫下晾干待檢。

1.4 檢測與分析方法

使用激光共聚焦掃描儀獲取16-bit tiff圖像文件，使用ImaGene3.0軟件分析對照組Cy3熒光標(biāo)記信號以及觀察組Cy5熒光信號強(qiáng)度變化和比值。通常以Ratio值在0.5～2.0之間為基因表達(dá)不存在顯著差異，此范圍之外為基因表達(dá)發(fā)生顯著改變，差異篩選標(biāo)準(zhǔn)Ratio為Cy5/Cy3，當(dāng)Ratio>2.0表示基因上調(diào)，<0.5則提示基因下調(diào)。

2 結(jié)果

2.1 檢測指標(biāo)對比

預(yù)定實驗周期4周，即于第28天測定3組大鼠的血糖、尿蛋白、血肌酐水平，結(jié)果表明對照組和觀察組大鼠血糖、血肌酐、尿蛋白均高于正常參考組，同時觀察組大鼠血糖、血肌酐、尿蛋白水平低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），這提示絞股藍(lán)總皂苷可有效降低DN大鼠血糖、血肌酐、尿蛋白水平。見表1。

2.2 基因芯片掃描結(jié)果

對處理好的基因芯片進(jìn)行掃描，獲得圖像后將觀察組和對照組大鼠圖像進(jìn)行疊加后掃描，結(jié)果顯示Cy3與Cy5熒光標(biāo)記信息獲取數(shù)量越多時兩者間差異越大，這提示對照組大鼠和觀察組大鼠腎皮質(zhì)基因表達(dá)譜在局部具有相似性，整體上仍存在較大差異。

2.3 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果

對2.2中的結(jié)果進(jìn)行深度分析后，發(fā)現(xiàn)在腎皮質(zhì)基因表達(dá)譜上觀察組和對照組共存在132條差異表達(dá)基因，根據(jù)預(yù)定Ratio值進(jìn)行劃分，其中133條下調(diào)基因，31條上調(diào)基因。其中可以明確的下調(diào)基因有糖基化終末受體基因、唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因、涎酸轉(zhuǎn)移酶基因、胰高血糖素受體基因、腎小球系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)聚集相關(guān)基因等，其中以胰高血糖素受體基因下調(diào)最明顯，可以明確的上調(diào)基因有絲氨酸蛋白抑制劑2b基因。見表2。

3 討論

有研究指出糖尿病腎病形成和發(fā)展與晚期糖基化終末產(chǎn)物有較大聯(lián)系，其與機(jī)體內(nèi)多種蛋白質(zhì)都可發(fā)生非酶糖基化變化，使其結(jié)構(gòu)、強(qiáng)度、溶解性、配位、交聯(lián)性質(zhì)發(fā)生改變，從而誘發(fā)糖尿病腎病，因此也有學(xué)者認(rèn)為晚期糖基化終末產(chǎn)物是糖尿病腎病發(fā)病的致病因子。當(dāng)然糖尿病腎病的發(fā)生和對腎皮質(zhì)基因表達(dá)譜的影響不僅僅局限于bank編號為NM-053336的晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGES），還對文中前述唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因、涎酸轉(zhuǎn)移酶基因、胰高血糖素受體基因、腎小球系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)聚集相關(guān)基因等基因表達(dá)有影響，但其中以糖基化終末受體最為典型，這與RAGES自身特點(diǎn)有密切聯(lián)系。

蛋白質(zhì)的糖基化具有明顯的組織特異性，在發(fā)育過程中受糖基轉(zhuǎn)化酶活性的影響，其中唾液酸轉(zhuǎn)移酶與涎酸轉(zhuǎn)移酶的活性增加后會增加糖基化終末產(chǎn)物的產(chǎn)量。而糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）可通過直接或間接兩種途徑對腎臟造成損傷。其直接作用如下，通過炎細(xì)胞介導(dǎo)造成基質(zhì)擴(kuò)張和腎小球硬化，引起腎小球基底膜支架結(jié)構(gòu)孔徑增大、通透性升高而引起蛋白尿，但此種直接損傷的程度相對有限，常見的損傷機(jī)制仍以間接為主，即通過與受體結(jié)合來釋放多種有害因子累及腎臟，使腎臟肥大、腎小球硬化、間質(zhì)纖維化等，因此從某種意義上來說抑制糖基化終末受體的產(chǎn)生可有效阻斷AGEs對腎臟的損傷，從而保護(hù)糖尿病機(jī)體的腎臟功能。

在該組研究中，用于治療DN大鼠的絞股藍(lán)皂苷是一種提取自葫蘆科植物絞股藍(lán)的活性物質(zhì)，以灌胃的方式應(yīng)用與實驗，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用后DN大鼠腎皮質(zhì)基因表達(dá)譜發(fā)生改變，其中主要的幾項與糖尿病腎病形成和發(fā)展的基因均下調(diào)，這提示絞股藍(lán)總皂苷具有明確延緩DN病理進(jìn)程的功效，因此具有臨床應(yīng)用的潛力。當(dāng)然高血糖仍是糖尿病腎病發(fā)生的始動因素，應(yīng)用絞股藍(lán)只是能夠有效延緩病情進(jìn)展，想要完全治愈DN仍需要長期的降糖治療。

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（收稿日期：2018-08-05）