李建省，楊維建，旦孝三，孫尚龍

甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

結(jié)腸癌是人類最常見的消化道惡性腫瘤之一，近些年發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，位居人類惡性腫瘤病死率的第3位［1-2］，嚴(yán)重危害人們的生命健康。目前臨床上對(duì)結(jié)腸癌的治療以綜合治療為主，采用放療、手術(shù)及中藥輔助化療的方法。腫瘤細(xì)胞的共性是細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制受到破壞導(dǎo)致細(xì)胞生長失控、分化受阻、衰老凋亡異常，而選擇保護(hù)正常組織并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡的新藥及有效的治療新方案，調(diào)節(jié)偏離細(xì)胞周期軌道的腫瘤細(xì)胞回到正常軌道上，是當(dāng)下抗腫瘤治療的策略之一［2］。近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)中藥及其提取物如：腸復(fù)康［3］、大蒜素［4］、黃連素、吳茱萸堿及小檗堿［5］等成分對(duì)體外培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞有抑制作用。本研究探索中藥腸瘤康(由黃芪、檳榔、皂角刺、大蒜素和莪術(shù)等組成)對(duì)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞周期的影響，探究中藥腸瘤康抑制腫瘤增殖的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用中藥抗腫瘤提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞購買于中國科學(xué)院上海生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究所，中藥腸瘤人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞購買于中國科學(xué)院上海生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究所，中藥腸瘤康提取液由甘肅省中醫(yī)院制劑室提供，酶標(biāo)儀(iMarkTM Microplate Reader，BIO-RAD)、流式細(xì)胞儀(ENC5V,USA)、二 甲 基 亞 砜 (DMSO)(NO.721D037)、RPMI-1640(AD19912263)購買自Solarbio公司。胎牛血清(RNBF3324)、MTT(SLBJ2169)、胰蛋白酶(SLBN6893V)、BCA試劑盒(RJ240514)、碘化丙啶(PI)(BCBN1506V)購買于Sigma公司。qPCR試劑盒均購自TaKaRa：PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒 (AI58964)，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(AI69802)，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清和1%PS[100 μL 鏈霉素(100 μg/mL)和 100 IU/mL 青霉素]的RPMI-1640完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞，接種至培養(yǎng)瓶后置于37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱，每3天傳代1次，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，開始實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為104mL接種于96孔板內(nèi)，待細(xì)胞完全貼壁后加入梯度濃度的腸瘤康溶液，分為對(duì)照組(腸瘤康 0 μg·ml-1)，腸瘤康高(100 μg·ml-1)、中(10 μg·ml-1)、低(0.1 μg·ml-1)劑量組及5-氟尿嘧啶組(5-氟尿嘧啶組4μg·ml-1)，并設(shè)置復(fù)孔。在加藥后的第24、48和72小時(shí)后加入MTT溶液，于37℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)后小心吸棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加150 μL的二甲基亞砜(DMSO)，用酶標(biāo)儀測定波長490 nm處各孔的吸光值即OD值。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù) 細(xì)胞周期：收集用腸瘤康和5-氟尿嘧啶干預(yù)24小時(shí)后的HT29細(xì)胞，用PBS洗滌、重懸，棄上清，加入碘化丙啶(PI)溶液，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，并用MUTCYCLE軟件分析細(xì)胞周期分布情況。

1.2.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測基因水平 將生長至對(duì)數(shù)期的結(jié)腸癌HT29細(xì)胞更換新鮮的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基后，用 0 μg/mL、0.1 μg/mL、10 μg/mL和100 μg/mL腸瘤康和5-氟尿嘧啶分別干預(yù)，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加適量Trizol、氯仿、異丙醇等提取各組細(xì)胞中的總RNA。取1 μL總RNA經(jīng)超微量分光光度計(jì)檢測A260/280的比值在1.8～2.0，提示RNA質(zhì)量較好?？俁NA用gDNA Eraser處理后，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將純化的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA作為模板進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒，在實(shí)時(shí)熒光定量Agilent(Mx3000P)PCR儀上進(jìn)行，分別擴(kuò)增p16、CyclinD1、CDK4、Rb mRNA(引物序列見表 1)。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)條件：預(yù)變性，95℃10分鐘，1個(gè)循環(huán)；熱循環(huán)，95℃15s，60℃15s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和溶解曲線，確認(rèn)得出的數(shù)據(jù)的可信性。計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量F=2-△△Ct。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，定量資料以(χ±s)表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)分析，方差不齊時(shí)用Dunnett′s方法分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腸瘤康對(duì)HT29細(xì)胞增殖的影響 腸瘤康能明顯抑制HT29細(xì)胞的增殖，隨著給藥劑量的增加，增殖抑制率呈上升趨勢，與對(duì)照組(0 μg/mL)相比(除24小時(shí)0.1 μg/mL腸瘤康組)，腸瘤康組增殖抑制率顯著升高（P＜0.05），有明顯的量效關(guān)系，也有一定的時(shí)間依賴性。見表2。

2.2 腸瘤康對(duì)HT29細(xì)胞周期的影響 在腸瘤康干預(yù)24小時(shí)后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞在G1期的比例顯著增加(P＜0.05)，S期的比例顯著降低(P＜0.05)。見表3。

2.3 腸瘤康對(duì) HT29細(xì)胞 p16、CyclinD1、CDK4、RbmRNA表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，p16和Rb基因在腸瘤康組中表達(dá)隨腸瘤康劑量增加依次升高；腸瘤康組CyclinD1和CDK4 mRNA的表達(dá)均下降，與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)，其中腸瘤康高劑量組下降最為顯著。見圖1。

表2 腸瘤康對(duì)結(jié)腸癌HT29細(xì)胞增殖抑制率的影響(χ±s) n=3

表3 腸瘤康對(duì)HT29細(xì)胞細(xì)胞周期的影響(χ±s) n=3

3 討論

細(xì)胞周期包含分裂間期和分裂期，分裂間期由G1期、S期和G2期組成，分裂期(M期)又分為前、中、后和末期。當(dāng)G1期細(xì)胞受到調(diào)節(jié)因子調(diào)控或外界因子干擾時(shí)會(huì)進(jìn)入既不生長也不分化的靜息狀態(tài)，即G0期［6］。近年來的研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞周期密切相關(guān)，而細(xì)胞周期的調(diào)控因子中包含多種癌基因和抑癌基因。細(xì)胞生長周期中，最重要的調(diào)控點(diǎn)是G1期與S期之間的調(diào)控點(diǎn)［7］。細(xì)胞周期的G1期與S期受細(xì)胞周期素依賴性激酶(CDKs)的活化物即細(xì)胞周期蛋白(Cyclins)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKIs)對(duì)CDKs的正負(fù)調(diào)節(jié)，也就是說細(xì)胞由G1期到S期的調(diào)控需CyclinD1的正調(diào)節(jié)和p16的負(fù)調(diào)節(jié)共同實(shí)現(xiàn)［8-9］。

在許多腫瘤中，CyclinD1由于基因擴(kuò)增、染色體易位或倒置、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)、mRNA穩(wěn)定性增強(qiáng)等導(dǎo)致其蛋白過度表達(dá)。而CyclinD1過度表達(dá)可使G1期縮短，促進(jìn)細(xì)胞增殖。CyclinD1基因是一種原癌基因，其蛋白的過表達(dá)與許多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［10-11］。CDKI包括2大類，一類是INK4(p15INKb、p16INKa、p18INKc、p19INKd)，主要抑制CDK4/6與CyclinD的結(jié)合及活性，抑制G1期；另一類是CIP/KIP(p21cip1/waf1、p27Kip1、p57Kip2)家族，主要抑制 CDK2、CDK3、CDK4/6，作用于細(xì)胞周期的多個(gè)階段［12］。p16蛋白與CDK競爭性結(jié)合CyclinD而阻礙CDK與CyclinD形成復(fù)合物，進(jìn)而導(dǎo)致CyclinD/CDK激酶失活，最終阻滯細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，細(xì)胞增殖受到抑制［13］。

中醫(yī)認(rèn)為結(jié)腸癌由機(jī)體正氣不足、濕毒瘀滯凝結(jié)而致病。根據(jù)中醫(yī)臨證辨證施治原則，腸瘤康以黃芪、檳榔、皂角刺、莪術(shù)、姜黃素、大蒜素和小檗堿等為主要成分，以補(bǔ)中益氣，清熱利濕為主要功能。研究表明：黃芪可將人宮頸癌C-33A細(xì)胞阻滯在G1［14］，也可將小鼠肝癌細(xì)胞和肉瘤細(xì)胞阻滯在G0期，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［15-16］。還有研究表明黃芪、莪術(shù)配伍使用對(duì)人卵巢癌HO-8910抑瘤效果明顯［17］。皂角刺及其提取物具有治療癌癥的作用，其中皂角刺總黃酮有抑制體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT1116增殖的作用，且有良好的量效關(guān)系［18-19］。

本實(shí)驗(yàn)研究表明：流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)腸瘤康作用于HT29細(xì)胞24小時(shí)后，濃度在0.1～100 μg/mL內(nèi)，細(xì)胞周期的G1期比例逐漸升高，S期比例明顯下降，存在G1/S阻滯。通過以上研究結(jié)果推測腸瘤康主要是通過阻滯HT29細(xì)胞G1期向S期的進(jìn)程，形成G1期阻滯，造成G1期細(xì)胞堆積并阻斷DNA合成和復(fù)制，從而影響細(xì)胞周期，起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。RT-PCR研究表明，與對(duì)照組相比，p16 mRNA 表達(dá)明顯增強(qiáng)，CyclinD1、CDK4、RbmRNA表達(dá)明顯下降。說明腸瘤康通過調(diào)控p16、CyclinD1、CDK4、Rb等細(xì)胞周期正負(fù)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)而發(fā)揮作用，最終抑制細(xì)胞周期順利進(jìn)行，而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。

綜上所述，腸瘤康誘導(dǎo)的HT29細(xì)胞凋亡，可能是通過使細(xì)胞阻滯G1期無法完成自修復(fù)而發(fā)揮抗腫瘤作用，其分子機(jī)制可能與抑制p16/CyclinD1/CDK4/Rb通路有關(guān)。