張海林 ，盧曉君 ，馮流暢 ，周珊珊 ，鄭小豐 ，王子燕 ，韋芳寧

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院；3廣東省中醫(yī)院

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)是世界性公共健康問題，國內(nèi)患病率高達(dá)5.4%～14.4%。最終發(fā)展為終末期腎病，給社會和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)，早期對慢性腎臟病防治顯得尤為重要，特別是從改變體質(zhì)開始［1］。體質(zhì)在許多情況下決定著機(jī)體對某些疾病的易患性和病變過程的傾向性。莫潤田等［2］對嶺南地區(qū)3 000名人群進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果提示濕熱質(zhì)1 188例，占39.6%，說明濕熱質(zhì)是長期在本地區(qū)居住人群的主要的偏頗體質(zhì)。濕熱體質(zhì)形成后，在致病因素的誘發(fā)下，容易形成不同疾病中的濕熱證，嚴(yán)重威脅人體的健康。濕熱證涉及中醫(yī)臟腑、經(jīng)絡(luò)7個系統(tǒng)的43種疾病，分屬于西醫(yī)的呼吸、泌尿等11個系統(tǒng)的72種急慢性疾?。?］。由此可見濕熱質(zhì)人群對多種疾病有易患性，而細(xì)胞黏附分子-1屬于細(xì)胞黏附分子免疫球蛋白超家族成員，具有參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)間黏附等作用；白細(xì)胞介素10(IL-10)是一種抑制性細(xì)胞因子，具有抑制促炎因子產(chǎn)生、抑制Th1細(xì)胞應(yīng)答等作用，目前已有研究證實(shí)ICAM1、IL-10與多種疾病發(fā)生發(fā)展有關(guān)。筆者對嶺南地區(qū)濕熱型體質(zhì)與CKD1期患者的ICAM1基因和IL-10基因啟動子的多態(tài)性進(jìn)行了探討，旨在基于基因水平上客觀認(rèn)識濕熱質(zhì)及慢性腎臟病的關(guān)系進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年5月至2016年1月在廣東省中醫(yī)院住院及門診就診的106例CKD1期患者，按體質(zhì)分為CKD1期濕熱質(zhì)組50例和CKD1期平和質(zhì)組56例；選擇102例健康體檢者，隨機(jī)分為健康濕熱質(zhì)組41例和健康平和質(zhì)組61例。CKD1期濕熱質(zhì)組中男21例，女29例，平均年齡(44.98±18.14)歲。CKD1期平和質(zhì)組中男19例，女37例，平均年齡(41.71±17.6)歲。健康濕熱質(zhì)組中男27例，女14例，平均年齡(35.44±12.28)歲。健康平和質(zhì)組中男31例，女30例，平均年齡(33.64±9.76)歲。4組基本資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),具有可比性。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 納入：1)符合慢性腎臟病的定義及分期［3］者；2)符合王琦的《中醫(yī)體質(zhì)學(xué)》［4］中濕熱質(zhì)、平和質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 排除：1)排除高血壓病、糖尿病、高脂血癥、心腦血管疾病者；2)嚴(yán)重肝腎疾病、腫瘤等疾病者。

1.4 方法

1.4.1 DNA提取 所有受試對象早晨空腹抽取靜脈血6 mL，EDTA抗凝管3 mL，采用天根生化有限公司血液基因組試劑盒，提取抗凝全血基因組DNA，嚴(yán)格按照說明書操作步驟進(jìn)行。無抗凝管3mL，在2小時內(nèi)3 000 rpm離心10分鐘后取上清液，用于ELISA實(shí)驗(yàn)檢測ICAM1、IL-10血清濃度。提取后的血清及抗凝管在-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 引物設(shè)計 引物均由上海生工公司設(shè)計共 3 對：ICAM1 基因 K469F：5′-CCCATAAGGTCTTGCCTCCA-3′，ICAM1 基 K469R:5′-CACCAATATGGGAAGGCCGA-3′；ICAM1 基因 G241F：5′-GATTGAAGAAGCCAGCAG-3′，ICAM1 基因 G241R:5′-GTCGTTGCCATAGGTGAC-3′；IL-10-F：5′-TGGCTCCCCTTACCTTCTAC-3′，IL-10-R:5′-GTCTCTGGGCCTTAGTTTCC-3′。

1.4.3 PCR擴(kuò)增及基因型分析 總反應(yīng)體系為25 μL，DNA 模板 1 μL，上、下游引物各 0.5 μL，dNTP0.5μL，Tag Butter2.5μL，Taq酶1U，水20μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)熱 30 min，94℃變性 30秒，65℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，循環(huán)變性、退火、延伸30次，72℃延伸3分鐘，4℃保存30分鐘。取1%瓊脂糖0.8 g，加0.5×TBE緩沖液，加熱溶解后冷卻至 60℃，加 10 mg/mL溴化乙錠 3 μL，取 5 μL PCR 產(chǎn)物與 1 μL6×Loading Buffer 混合加樣，并用5 μL 100 bp ladder作為參照，在120 V下電泳30分鐘，在凝膠成像儀上拍照保存見圖1。驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物為目的片段后，由上海生工生物公司完成測序。

圖1 1%瓊脂糖電泳圖(IL-10)

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，4組間基因型分布及基因頻率為計數(shù)資料，采用χ2檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的定量資料，采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-10基因及ICAM1基因多態(tài)性分析 4組IL-10 基因啟動子 -1082(A/C)、-819(C/T)、-592(A/C)位點(diǎn)基因型分布及基因頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；4組ICAM1基因G241(G/R)和K469(G/A)位點(diǎn)基因型分布及基因頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1-5。

2.2 ICAM1、IL-10血清濃度 4組間ICAM1血清濃度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，4組間IL-10血清濃度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。見表6-7。

表1 各組ICAM-1 G241位點(diǎn)基因型及基因頻率分布比較

表2 各組ICAM-1 K469位點(diǎn)基因型及基因頻率分布

表3 各組IL-10-592位點(diǎn)基因型及基因頻率分布

表4 各組IL-10-819位點(diǎn)基因型及基因頻率分布

表5 各組IL-10-1082位點(diǎn)基因型及基因頻率分布

表6 各組ICAM-1血清濃度分布 μg/L

表7 各組IL-10血清濃度分布 μg/L

2.3 不同基因型的ICAM濃度 CKD1期患者中83例含ICAM1 G241位點(diǎn)GG基因型ICAM1期濃度(534529.2±748916.9)μg/L，CKD1 患者中 31例含ICAM1 G241位點(diǎn)GR基因型ICAM1濃度(834794.8±735658.3)μg/L。健康人中65例含ICAM1 G241位點(diǎn)GG基因型 ICAM1濃度(382 891.9±687 828.4)μg/L，健康人中25例含ICAM1 G241位點(diǎn)GR基因型ICAM1 濃度(543 928.9±482 480.1)μg/L，經(jīng)秩和檢驗(yàn)，P=0.003，含有G241位點(diǎn)GG基因型血清ICAM1濃度顯著比含有GR基因型低 (P＜0.05)。CKD1患者中47例含ICAM1 K469位點(diǎn)AG基因型ICAM1濃度(801757.4±981182.3)μg/L，CKD1 患者中6例含ICAM1 K469位點(diǎn)GG基因型ICAM1濃度(882 012.6±519-30.0)μg/L，CKD1 患者中 49例含 ICAM1 K469位點(diǎn)AA基因型 ICAM1濃度(507 561.5±501 763.5)μg/L。健康人中 55例含ICAM1 K469位點(diǎn)AA基因型ICAM1濃度478 901.6±685809.4)μg/L，健康人中 44 例含ICAM1 K469位點(diǎn)AG基因型ICAM1濃度(307 328.9±535061.7)μg/L，健康人中2例含ICAM1 K469位點(diǎn)GG基因型ICAM1濃度(135 761.0±191 361.4)μg/L。在CKD1期患者中含有K469位點(diǎn)不同基因型血清ICAM1濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；在健康人中含有K469位點(diǎn)不同基因型血清ICAM1濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

ICAM-1是存在于多種細(xì)胞表面的誘導(dǎo)性糖蛋白，致炎因子、感染、應(yīng)激等主要通過激活I(lǐng)CAM-1基因的轉(zhuǎn)錄，增加在炎癥性疾病中的表達(dá)［3-5］。目前相關(guān)研究證實(shí)，ICAM-1基因表達(dá)與多種疾病相關(guān)，但未考慮體質(zhì)因素，本研究探討了ICAM-1基因多態(tài)性與CKD和濕熱質(zhì)的相關(guān)性。路方紅等［5］研究發(fā)現(xiàn)，中國漢族人群存在ICAM-1 K469基因多態(tài)性，其中K基因有可能是冠心病遺傳危險因素。蔣輝華等［6］研究發(fā)現(xiàn)，漢族人腦梗死面積不同也與ICAM-1指標(biāo)相關(guān)，E等位基因可能是影響漢族人腦梗死的等位基因。姜玉姬等［7］研究結(jié)果證實(shí)ICAM-1參與IgA腎病的進(jìn)展，腎小管間質(zhì)ICAM-1的表達(dá)可能與IgA腎病進(jìn)行性損傷有關(guān)。本研究中4組ICAM1基因G241(G/R)和K469(G/A)位點(diǎn)基因型分布及基因頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示未發(fā)現(xiàn)濕熱質(zhì)CKD1期患者ICAM-1 K469、G241基因多態(tài)性，但研究結(jié)果提示4組ICAM-1血清濃度有明顯統(tǒng)計學(xué)差異，且CKD1期濕熱質(zhì)ICAM-1 血清濃度(699 653.80±856 250.14)μg/L最高，CKD1期平和質(zhì)ICAM-1血清濃度(635 662.87±697 397.60)μg/L次之，說明ICAM-1血清濃度與CKD1期濕熱質(zhì)相關(guān)，而ICAM-1與炎癥反應(yīng)相關(guān)，為濕熱體質(zhì)人群對慢性腎臟病易感性提供客觀依據(jù)，且含有G241位點(diǎn)GG基因型血清ICAM1濃度顯著比含有GR基因型低。進(jìn)一步說明ICAM-1 G241位點(diǎn)GG基因型可能是慢性腎臟病、濕熱質(zhì)預(yù)測基因。且通過G241位點(diǎn)GG基因型調(diào)控ICAM1，使得ICAM1的表達(dá)下調(diào)，血清ICAM1濃度降低，減少炎癥反應(yīng)。IL-10主要有抑制多種促炎因子產(chǎn)生，抑制巨噬細(xì)胞抗原提升功能，抑制Th1細(xì)胞應(yīng)答等作用。目前有研究證實(shí),IL-10啟動子區(qū)不同位點(diǎn)與多種疾病有相關(guān)性。

吳紹燕等［8］研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者與幽門螺旋桿菌感染者存在IL-10-592位點(diǎn)多態(tài)性，說明IL-10-592基因是幽門螺旋桿菌相關(guān)性胃癌的易感基因。朱麗晶等［9］發(fā)現(xiàn)IL-10基因-592A/C多態(tài)性在正常人群與LN患者分布無顯著差異，但是IL-10基因多態(tài)性與LN活動性相關(guān)。吳紅赤等［10］發(fā)現(xiàn)，正常人及終末期腎病患者IL-10-1082A/G基因型分布及基因頻率無統(tǒng)計學(xué)差異，但是IL-10-1082A/A基因型患者IL-10水平顯著低于A/G、G/G基因型。本研究與前兩者研究結(jié)果一致，狼瘡性腎病、終末期腎病均屬于慢性腎臟病。本研究中4組IL-10基因啟動子-1082(A/C)、-819(C/T)、-592(A/C)位點(diǎn)基因型分布及基因頻率無統(tǒng)計學(xué)差異，且4組間IL-10濃度無統(tǒng)計學(xué)差異。該研究說明4組人群中不存在IL-10 基因啟動子 -1082(A/C)、-819(C/T)、-592(A/C)位點(diǎn)基因多態(tài)性，IL-10濃度可能不受IL-10 基因啟動子 -1082(A/C)、-819(C/T)、-592(A/C)調(diào)控。

綜上所述，濕熱質(zhì)人群是慢性腎臟病的易感人群，ICAM-1 G241位點(diǎn)GG基因型與慢性腎臟病、濕熱質(zhì)有著密切的關(guān)系。G241位點(diǎn)GG基因型是慢性腎臟病保護(hù)基因，該基因調(diào)控ICAM1，使得ICAM1的表達(dá)下調(diào)，血清ICAM1濃度降低，減少炎癥反應(yīng)。提示通過調(diào)整ICAM-1的表達(dá)，可以糾正體質(zhì)，特別是體質(zhì)的偏頗狀態(tài)，達(dá)到預(yù)防或減少慢性腎臟病發(fā)生或發(fā)展的目的。