李春紅

(南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院藥學(xué)部，南昌 330003)

以獨(dú)活、羌活、威靈仙、川芎、紅花、木瓜、冰片的所組成的中藥復(fù)方，具有祛風(fēng)除濕、消腫止痛之功效，在中醫(yī)臨床上用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打扭傷，效果顯著。經(jīng)處方方解與現(xiàn)代藥學(xué)文獻(xiàn)研究，獨(dú)活為本復(fù)方君藥，具有祛風(fēng)除濕，通痹止痛之功效，其香豆素類成分為消腫止痛的主要活性物質(zhì)，文獻(xiàn)多以蛇床子素作為質(zhì)控指標(biāo)[1]；羌活、威靈仙為臣藥，其中，羌活具有祛風(fēng)除濕功效，文獻(xiàn)報道羌活醇、紫花前胡苷和歐前胡素等香豆素類成分均具有較強(qiáng)的藥理活性，為鎮(zhèn)痛作用的主要活性物質(zhì)，用于治療各種跌打損傷所致的瘀血腫痛[2]；威靈仙具有祛風(fēng)濕，通經(jīng)絡(luò)之功效，是祛風(fēng)止痛丸等中成藥重要組成藥味，其中威靈仙里的總皂苷具有顯著鎮(zhèn)痛作用[3]。川芎、紅花、木瓜為本方中佐藥，其中紅花具有活血通經(jīng)，散瘀止痛之功效，羥基紅花黃色素A為活血化瘀作用的主要有效成分，具有改善血液循環(huán)作用，在臨床上主要用于治療跌打損傷疾病[4]。冰片為本方使藥，具有促進(jìn)藥物吸收作用。作為臨床經(jīng)驗方，已有數(shù)十年的臨床實踐，為進(jìn)一步研究開發(fā)成新藥，筆者對本復(fù)方進(jìn)行了提取工藝研究。

鑒于復(fù)方中藥具有多組分、多靶點的特點，設(shè)置多指標(biāo)檢測標(biāo)準(zhǔn)已成為優(yōu)化中藥復(fù)方制劑提取工藝的重要手段。現(xiàn)在中藥提取工藝綜合評價中常用的是經(jīng)驗性權(quán)數(shù)法，它是由專家或主研者根據(jù)評價指標(biāo)的重要性來確定權(quán)重系數(shù)，受主觀因素影響較大[5-8]。本研究采用的層次分析法(AHP)，它是在專家的主觀判斷基礎(chǔ)上做了進(jìn)一步數(shù)學(xué)處理，使之更加科學(xué)化。針對該方的特點，為提高該產(chǎn)品質(zhì)量，作者采用正交設(shè)計試驗法優(yōu)選該組方的提取工藝，以蛇床子素、紫花前胡苷、羥基紅花黃色素A轉(zhuǎn)移率與處方出膏率為評價指標(biāo)，并對各指標(biāo)給予權(quán)重，綜合評價提取工藝，優(yōu)化出了本組方的最佳提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（SPD-20A，LC-20AD，島津公司）；AglientSB-C18 （5ul，4.6*250mm）；KQ-250DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；Sartorius BS 224s電子天平 (北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；W201D恒溫水浴鍋(上海申順生物科技有限公司)。

1.2 試藥 蛇床子素對照品（中國食品藥品檢定研究院，110822-201308）；紫花前胡苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，111821-201303）；羥基紅花黃色素A對照品 （中國食品藥品檢定研究院，1116320-201308）。甲醇、乙腈為色譜純，二次蒸餾水（water公司），其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 實驗設(shè)計 前期基礎(chǔ)研究表明本復(fù)方適應(yīng)回流提取。根據(jù)該復(fù)方化學(xué)成分理化性質(zhì)，以及醇提工藝常見影響因素，前期研究工作主要對醇提取濃度、提取時間、提取次數(shù)、溶劑體積等進(jìn)行了單因素考察，最終確定了醇提工藝影響因素水平（表1）。

2.2 正交試驗 按照正交試驗L9(43)進(jìn)行試驗，分別以蛇床子素、紫花前胡苷、羥基紅花黃色素A轉(zhuǎn)移率（%）與處方出膏率（%）為評價指標(biāo)，按照多指標(biāo)權(quán)重分析進(jìn)行綜合總評分，并進(jìn)行直觀分析與方差分析。

表1 L9(43)因素和水平

2.3 AHP法確定指標(biāo)權(quán)重

2.3.1 建立優(yōu)先矩陣 根據(jù)復(fù)方中的藥味君臣佐使配伍規(guī)律，獨(dú)活作為本方君藥，其主要有效成分蛇床子素作為質(zhì)控指標(biāo)。羌活為臣藥，紫花前胡苷為主要鎮(zhèn)痛作用的成分；威靈仙雖為本方臣藥，但其在中國藥典上質(zhì)控指標(biāo)齊墩果酸與木瓜具有相同的質(zhì)控指標(biāo)，故選定紫花前胡苷作為質(zhì)控指標(biāo)；川芎在中國藥典以阿魏酸作為質(zhì)控指標(biāo)，但阿魏酸不穩(wěn)定。紅花為佐藥之一，其羥基紅花黃色素A為活血化瘀作用的主要有效成分，因此選其作為質(zhì)控指標(biāo)之一。綜合分析各味中藥的主要藥效成分及成分藥理作用強(qiáng)弱，本實驗將蛇床子素、紫花前胡苷、羥基紅花黃色素A、出膏率作為工藝控制指標(biāo)，并確定各指標(biāo)的優(yōu)先順序：蛇床子素＞紫花前胡苷＞羥基紅花黃色素A＞出膏率，構(gòu)建成對比較的判斷優(yōu)先矩陣，賦予各項指標(biāo)間的相對評分，指標(biāo)成分比較的優(yōu)先矩陣（表3）。

表2 指標(biāo)成對比較判斷優(yōu)先矩陣

2.3.3 一致性比率 CR=CI/RI，作為衡量所得權(quán)重系數(shù)是否合理的指標(biāo)，經(jīng)計算出CR=CI/RI=0.0091/0.106=0.086＜0.1，符合并滿足一致性要求，表明指標(biāo)合理可行。

2.4 指標(biāo)性成分測定

2.4.1 HPLC方法測定蛇床子素含量的色譜條件色譜柱為 AglientSB-C18（5μm，4.6×250mm）；流動相乙腈-水（65-35）；檢測波長 330mm；柱溫 25℃；進(jìn)樣體積 5μl；流速 1ml/min。

2.4.2 HPLC方法測定紫花前胡苷含量的色譜條件色譜柱為 AglientSB-C18（5μm，4.6×250mm）；流動相甲醇-水（32-68）；檢測波長 310mm；柱溫25℃；進(jìn)樣體積 5μl；流速 1ml/min。

2.4.3 HPLC方法測定羥基紅花黃色素A含量的色譜條件 色譜柱為 AglientSB-C18 （5μm，4.6×250mm）；流動相乙腈-甲醇-0.7%磷酸溶液（2-26-72）；檢測波長 403mm；柱溫 25℃；進(jìn)樣體積 10μl；流速1ml/min。

2.4.4 出膏率測定 精密吸取各正交試驗樣品提取液25ml，置于已干燥恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，于105℃烘箱中干燥3h，取出置干燥器內(nèi)冷卻30min，迅速精密稱重，計算浸出物得率。

3 結(jié)果

按照正交試驗L9(43)進(jìn)行試驗，以HPLC法測定各指標(biāo)的含量，并計算其轉(zhuǎn)移率，以2.2確認(rèn)的權(quán)重分別計算出9組正交試驗綜合評分 （總得分），總得分 （M）=0.4668*蛇床子素轉(zhuǎn)移率+0.2776*紫花前胡苷轉(zhuǎn)移率+0.1603*羥基紅花黃色素A轉(zhuǎn)移率+0.0953*出膏率，結(jié)果見表3。

表3 正交試驗得分表

以綜合評分為標(biāo)準(zhǔn)，對表3中數(shù)據(jù)直觀分析表明（表4），最佳提取工藝為A2B2C2D3，經(jīng)方差分析，因素A、B、C、D對實驗結(jié)果均無顯著影響，但鑒于D2與D3項水平間差異不大，考慮到生產(chǎn)成本和環(huán)保因素，最終確認(rèn)生產(chǎn)工藝為A2B2C2D2，即加入10倍溶劑體積的70%乙醇量，加熱回流提取兩次，每次1h。

表4 正交試驗直觀分析

按照正交試驗優(yōu)選出的提取工藝A2B2C2D2，平行進(jìn)行3組驗證實驗，測定各指標(biāo)轉(zhuǎn)移率和浸出物出膏率，根據(jù)2.2指標(biāo)權(quán)重計算三組驗證試驗綜合評價總得分分別為80.10、80.10、79.57，總得分RSD為0.58%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

4 討論

采用多指標(biāo)正交實驗進(jìn)行工藝優(yōu)選時，要解決指標(biāo)成分間量綱不一致矛盾問題，因此需要引入權(quán)重，根據(jù)復(fù)方配伍規(guī)律，充分考慮到中藥有效成分指標(biāo)理化特性，合理地設(shè)置監(jiān)測指標(biāo)并引入權(quán)重，可大大降低了分析難度。由于本制劑研究測定的指標(biāo)性成分，如蛇床子素、紫花前胡苷、羥基紅花黃色素A等指標(biāo)性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)大都具有消腫止痛，改善微循環(huán)等功效，以這些藥效指標(biāo)控制工藝和評價本中藥制劑質(zhì)量，可保證制劑藥效更加科學(xué)合理。