范彩霞

(江西省撫州市中心血站，撫州 344000)

為了確保臨床用血安全，提高窗口期和變異病毒株的檢出，最大限度地減少方法學(xué)引起的差異，國家衛(wèi)計(jì)委強(qiáng)烈地要求全國的采供血機(jī)構(gòu)需全面普及核酸檢測(cè)。撫州市中心血站從2015年6月開始嚴(yán)格按照國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)下發(fā)的《關(guān)于做好血站核酸檢測(cè)工作的通知》的要求籌建核酸實(shí)驗(yàn)室，2016年全面開展 HBV、HCV和HIV(1型)核酸檢測(cè)用于臨床用血的篩查。本文通過對(duì)2016年我站的獻(xiàn)血者20763例標(biāo)本酶聯(lián)免疫吸附聯(lián)合核酸檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，探討核酸檢測(cè)用于獻(xiàn)血者臨床輸血安全篩查的重要性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 采集2016年1-12月?lián)嶂菔兄行难?0763位無償獻(xiàn)血者血漿。所有無償獻(xiàn)血者均符合我國GB18467《獻(xiàn)血者健康檢查要求》的標(biāo)準(zhǔn)。采血后留取真空抗凝管5ml，所有標(biāo)本均在冷鏈保證情況下送到站內(nèi)，低溫離心保存，在72h內(nèi)完成輸血前檢測(cè)。

1.2 儀器與試劑 ELISA檢測(cè)試劑盒由廈門新創(chuàng)科技有限公司和北京萬泰科技有限公司提供。ChiTaSBSS1200全自動(dòng)核酸提取儀 （蘇州新波生物技術(shù)有限公司）及配套試劑和ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 （愛普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。HBV、HCV和HIV(1型)核酸檢測(cè)試劑盒Real Time-PCR由上海浩源生物科技有限公司提供。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3 ELISA血清學(xué)檢測(cè) 用廈門新創(chuàng)和北京萬泰二種ELISA檢測(cè)試劑盒同時(shí)對(duì)20763份無償獻(xiàn)血者標(biāo)本進(jìn)行HBV抗原、HCV和HIV抗體檢測(cè)。一種ELISA方法檢出陽性或二種均為陽性的標(biāo)本剔除。兩次ELISA該三項(xiàng)指標(biāo)均為陰性且其他項(xiàng)目檢測(cè)合格的樣本進(jìn)行8混樣混合后做HBV-DNA、HCV-RNA、HIV(1型)-RNA核酸檢測(cè)。

1.4 核酸提取和PCR擴(kuò)增 參照試劑盒說明書用ChiTaSBSS1200系統(tǒng)及配套試劑進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)HBV-DNA、HCV-RNA、HIV(1型)-RNA 病毒核酸。病毒核酸提取采用磁珠法，血漿標(biāo)本及內(nèi)對(duì)照經(jīng)裂解液處理后釋放出基因組核酸，加入表面包被有二氧化硅的磁珠顆粒，在高鹽環(huán)境下帶負(fù)電荷的核酸吸附到帶正電荷的磁珠顆粒表面。純化的病毒及內(nèi)對(duì)照核酸在洗脫液提供的環(huán)境及特定溫度下從磁珠顆粒表面洗脫下來成為PCR擴(kuò)增的模板。PCR擴(kuò)增檢測(cè)采用TagMan熒光探針標(biāo)定技術(shù)。HBV、HCV、HIV(1型)病毒核酸擴(kuò)增在同一管內(nèi)分別采用不同熒光染料標(biāo)記的探針，故可同時(shí)檢測(cè)該3種病毒核酸。在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下HCV-RNA/HIV(1型)-RNA/內(nèi)對(duì)照RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再與HBV-DNA/內(nèi)對(duì)照DNA一同作為模板在TaqDNA聚合酶的作用擴(kuò)增病毒核酸的保守區(qū)域和內(nèi)對(duì)照特定區(qū)域。TaqDNA聚合酶5′-3′外切酶活性切割反應(yīng)系統(tǒng)中帶熒光標(biāo)記的TaqMan探針產(chǎn)生熒光信號(hào)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，熒光信號(hào)不斷積累。Real Time-PCR法通過檢測(cè)達(dá)到和超過熒光閾值的信號(hào)給出標(biāo)本的陰陽性結(jié)果。核酸檢測(cè)陽性樣本送國家衛(wèi)計(jì)委臨床檢驗(yàn)中心做比對(duì)試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測(cè)結(jié)果 20763份無償獻(xiàn)血標(biāo)本中有20426份合格標(biāo)本用于核酸檢測(cè)。其中不合格標(biāo)本為HBsAg陽性標(biāo)本194份、抗-HCV陽性標(biāo)本34份、抗-HIV-1/2陽性標(biāo)本13份。其他項(xiàng)目不合格標(biāo)本共99份，其中抗-TP 46份，ALT53份（見表1）。

2.2 核酸檢測(cè)結(jié)果 對(duì)20426份血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果合格的標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測(cè)結(jié)果為核酸反應(yīng)性標(biāo)本50例（HBV-DNA49例及HIV(1型)-RNA 1例），核酸反應(yīng)性標(biāo)本陽性率2.45‰。最后將這50例核酸反應(yīng)性標(biāo)本連同血漿袋一起送往國家衛(wèi)計(jì)委臨檢中心做比對(duì)試驗(yàn)，其結(jié)果是49份HBV-DNA陽性標(biāo)本中有45份為陽性，4份為陰性；1份HIV(1型)-RNA陽性標(biāo)本經(jīng)國家衛(wèi)計(jì)委臨檢中心檢測(cè)為陰性（見表2），核酸檢測(cè)陽性符合率為90%，符合國家相關(guān)要求。

3 討論

從表1、2中可以看出核酸檢測(cè)聯(lián)合酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)比單純的ELISA檢測(cè)更安全。酶聯(lián)免疫吸附法的檢測(cè)方法較為局限性，以窗口期進(jìn)行，細(xì)胞抗原、抗體的蛋白結(jié)構(gòu)易變性，純粹的抗體、抗原ELISA檢測(cè)還是具有一定的輸血安全風(fēng)險(xiǎn)性。而NAT檢測(cè)的是病毒核酸。兩者在檢測(cè)原理及方法上均存在差異。本實(shí)驗(yàn)室曾將ELISA檢測(cè)抗-HCV陽性的標(biāo)本進(jìn)行NAT檢測(cè)，結(jié)果并非都是NAT陽性，所以兩種方法的檢測(cè)結(jié)果有互補(bǔ)之效。增加NAT檢測(cè)是對(duì)ELISA的有效補(bǔ)充，能夠使現(xiàn)有的獻(xiàn)血體系更加完善，使輸血傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)降到最低。為了保證血液質(zhì)量及輸血安全，在獻(xiàn)血者血液篩查的兩遍酶免檢測(cè)的基礎(chǔ)上增添核酸檢測(cè)是很有必要的[1-4]。

2016年采集的20763份標(biāo)本中，ELISA檢測(cè)合格標(biāo)本數(shù)為20426份，陽性標(biāo)本數(shù)為337份，其中包括HBsAg陽性標(biāo)本194份；有1份標(biāo)本既是HBsAg陽性又是抗-TP陽性標(biāo)本；有2份標(biāo)本既是HBsAg陽性又是ALT不合格標(biāo)本；ALT不合格標(biāo)本53份，分別占不合格標(biāo)本的58.46%和16.32%。由此可見，在我們的無償獻(xiàn)血人群中感染乙肝的人群占了較大的比例[5]，其次是ALT不合格的人群。

表1 2016年撫州市中心血站無償獻(xiàn)血者ELISA法檢測(cè)結(jié)果表

表2 50例核酸反應(yīng)性標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果及國家衛(wèi)計(jì)委臨檢中心檢測(cè)結(jié)果對(duì)照表

另從核酸及ELISA檢測(cè)結(jié)果分析表明，在乙型肝炎病毒 （HBV）感染檢測(cè)中，NAT除可縮短HBV感染檢測(cè)的窗口期外，還可減少HBV急性感染恢復(fù)期、慢性隱匿性HBV感染以及變異病毒株感染的漏檢。有文獻(xiàn)報(bào)道[6，7]，核酸檢測(cè)技術(shù)平均可將HBV、HCV、HIV感染 “窗口期”由原來的56d、82d、22d， 縮短至 33d、22d、11d， 分別縮短 40%、73%和50%。由此可見，核酸檢測(cè) （nucleic acid test，NAT）可以有效地縮短病毒特異抗原和抗體免疫測(cè)定的“窗口期”。

綜上所述，核酸檢測(cè)技術(shù)能有效地降低酶聯(lián)免疫法漏檢造成的輸血風(fēng)險(xiǎn)，故核酸檢測(cè)和酶聯(lián)免疫檢測(cè)相結(jié)合做為血液篩查檢測(cè)的重要手段，可以大大地提高輸血安全。