盧 娜， 李成長， 羅曉秋， 楊坤麗

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

RNA干擾(RNAi)是有效沉默或抑制目標(biāo)基因表達(dá)的過程，該過程通過雙鏈RNA(dsRNA)使得目標(biāo)基因相應(yīng)的mRNA選擇性失活來實(shí)現(xiàn)的，目前廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究[1]。短發(fā)夾RNA(RNA-short hairpin RNA，shRNA)作為一種重要的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，在使用慢病毒作為載體介導(dǎo)shRNA轉(zhuǎn)染時，轉(zhuǎn)染效率高，毒性低，可感染分裂細(xì)胞和未分裂細(xì)胞，可將基因穩(wěn)定地整合于宿主細(xì)胞的基因組中，且高效穩(wěn)定的表達(dá)，現(xiàn)已廣泛用于體內(nèi)外研究。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建干擾Beclin-1表達(dá)的慢病毒載體，建立穩(wěn)定的細(xì)胞株，并探索低氧刺激下，shRNA Beclin-1對細(xì)胞自噬有何影響，為后續(xù)研究低氧激活自噬的信號通路奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞株由上海中科院典型細(xì)胞培養(yǎng)庫提供；MEM培養(yǎng)液、F12、Sodium pyruvate、NEAA購于invitrogen；胎牛血清購于美國Hyclone公司；CCK-8試劑盒購自Dojindo；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和細(xì)胞蛋白提取試劑盒購自Fermentas；RT-PCR試劑盒購自TaKaRa；人抗Beclin-1、LC3B多克隆抗體購自Cell Signalling；Thermo Scientific 三氣培養(yǎng)箱、OLYMPUS IX71熒光顯微鏡、Roche480熒光定量PCR儀、HR40-IIA2生物安全柜。

1.2 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞置于含10%胎牛血清的高糖MEM完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)液中含F(xiàn)12、Gluta-max、Sodium pyruvat、NEAA，在37℃、5% CO2的飽和水氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48 h換培養(yǎng)液，當(dāng)單層細(xì)胞融合后，行傳代處理。

1.3 CCK-8比色法檢測細(xì)胞存活率

取對數(shù)生長期細(xì)胞，以2×104個L-1接種于96孔板，每孔細(xì)胞懸液100 μl。在37℃、5% CO2的飽和水氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。處理后，每孔加10 μl CCK-8溶液，避光孵育2 h，酶標(biāo)儀在波長450 nm 處讀取吸光度(absorbance，A)值，用8個復(fù)孔A值的均數(shù)計(jì)算存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。將對照組的A值表示為A對照，處理各組樣本的A 表示為A處理，存活率按下式計(jì)算: 存活率=A處理/A對照×100%。本實(shí)驗(yàn)對照組的細(xì)胞存活率定為100.00%。

1.4 Western blot法檢測蛋白表達(dá)

收獲細(xì)胞，4℃預(yù)冷的PBS洗1次，加入適量的細(xì)胞裂解液，刮下細(xì)胞，12 000 g 離心10 min，取上清液。用BCA法測定各組蛋白含量，每孔上樣25 μl，經(jīng)15% SDS-PAGE 80 V電泳2 h后，300 MA恒流轉(zhuǎn)膜40 min，5% 脫脂牛奶常溫下封閉1 h后，在 4℃ 孵育一抗(兔抗人Beclin1及LC3B滴度均為1∶3 000)；5%脫脂牛奶常溫下封閉二抗( 羊抗兔辣根過氧化物酶IgG 和羊抗小鼠辣根過氧化物酶IgG 滴度均為 1∶5 000，5% 脫脂牛奶配制)，ECL 顯影顯示目的條帶和內(nèi)參，用ImageJ軟件分析光密度值，代表蛋白表達(dá)的相對水平。

1.5 靶向Beclin-1 shRNA慢病毒表達(dá)載體制備

1.5.1 根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)合成shRNA 根據(jù)human Beclin-1的參考序列號NM_003766.4，從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取Beclin-1的mRNA序列信息，根據(jù)獲取的序列信息以及siRNA的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)兩組不同的shRNA靶序列，并采用scrambler工具準(zhǔn)備對應(yīng)的scrambled control shRNA序列。

1.5.2 構(gòu)建慢病毒shRNA載體 進(jìn)行全基因合成后，分別使用無菌水將每條shRNA的兩條鏈按照1∶1的比例混合，進(jìn)行退火形成雙鏈。將慢病毒shRNA表達(dá)載體Lenti-U6-shRNA-GFP使用EcoRI-BamHI進(jìn)行雙酶切，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，回收酶切后的載體，與上述退火后的shRNA片段進(jìn)行T4 DNA連接酶連接。連接體系如表1：

Tab. 1 shRNA cloning system

將上述T4 DNA連接體系置于16°C連接過夜后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)stbl3細(xì)胞中，涂布氨芐抗性的LB平板后，置于37°C過夜培養(yǎng)，第二日挑取單克隆細(xì)胞進(jìn)行小規(guī)模搖菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA后，進(jìn)行Sanger測序。

1.5.3 Snager測序驗(yàn)證 將小抽的質(zhì)粒，使用U6啟動子通用引物測序，將測序結(jié)果與設(shè)計(jì)的shRNA 標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對，確認(rèn)插入載體中的序列正確后，制備無內(nèi)毒素質(zhì)粒。

1.6 慢病毒制備

1.6.1 慢病毒的包裝 取15 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，接種5×106個293T細(xì)胞/皿。將轉(zhuǎn)染試劑LVTransm及慢病毒包裝質(zhì)粒(Lenti-shRNA-GFP、Lenti-packaging Mix)完全混勻后，逐滴加入到15 cm培養(yǎng)皿中，充分混勻，培養(yǎng)6～8 h后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集培養(yǎng)皿中含有病毒的培養(yǎng)基上清至一個50 ml離心管中；向培養(yǎng)皿內(nèi)重新加入25 ml左右新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；收集培養(yǎng)皿中含有病毒的培養(yǎng)基上清至50 ml離心管中；向培養(yǎng)皿內(nèi)重新加入25 ml左右新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；收集培養(yǎng)皿中含有病毒的培養(yǎng)基上清，并與前面收集的兩次培養(yǎng)基上清混合。

1.6.2 慢病毒濃縮及純化 將上述收集的含有慢病毒的培養(yǎng)基上清，用0.45 μm的PES材質(zhì)濾膜過濾后，轉(zhuǎn)至無菌離心管中，50 000 g 4°C離心2 h。棄上清，加入1 ml PBS緩沖液將沉淀重懸，將病毒置于-80°C保存。

1.6.3 慢病毒滴度測定 將對數(shù)生長期的293T細(xì)胞以5×106個/孔接種于24孔板，補(bǔ)充培養(yǎng)基至終體積為500 μl，將24孔板置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中，過夜培養(yǎng)。將濃縮后的慢病毒按照1 μl的量加入至上述24孔板中，同時添加終濃度為6 μg/ml的polybrene。將24孔板重新放回37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中，連續(xù)培養(yǎng)96 h。培養(yǎng)結(jié)束后，使用PBS洗滌每孔的細(xì)胞，然后使用Genomic DNA Purification Kit (Lifetech，CAT#K0512)提取基因組DNA，并使用NanoDrop2000測定所提取的基因組DNA的濃度。將pUC-WPRE和pUC-ALB質(zhì)粒，分別按照10倍稀釋，準(zhǔn)備熒光定量PCR所需的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。所用引物的序列及熒光基團(tuán)如表2所示，取96孔PCR反應(yīng)板，按照每孔加入5 μl基因組樣品或標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，然后向每孔加入15 μl上述制備的PCR反應(yīng)預(yù)混液，使用封膜密封后，短暫離心1 min，進(jìn)行PCR反應(yīng)。

Tab. 2 Probe and primer sequences information table

1.6.4 嘌呤霉素殺傷曲線 按照5×104個細(xì)胞/孔的密度將對數(shù)生長期的靶細(xì)胞SH-SY5Y接種至24孔板中，過夜培養(yǎng)。使用完全培養(yǎng)基制備2X的梯度稀釋puromycin，終濃度分別為0.5 μg/ml、1 μg/ml、2 μg/ml、4 μg/ml、8 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml；從培養(yǎng)箱中取出接種有靶細(xì)胞的24孔板，從每孔中吸出250 μl培養(yǎng)基丟棄，然后分別加入250 μl 2×的puromycin。小心混勻后，繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，以在第五日能夠完全殺死所有靶細(xì)胞的puromycin濃度作為篩選穩(wěn)定細(xì)胞株的濃度。

1.6.5 穩(wěn)定細(xì)胞株篩選 將處于對數(shù)生長期的SH-SY5Y，按照5×105個細(xì)胞/孔的密度接種至6孔板中，并加入3 ml完全培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)。按照MOI=20，根據(jù)接種細(xì)胞數(shù)以及病毒滴度計(jì)算所需的病毒量。將慢病毒加入6孔板中，800 g室溫離心1 h；取出孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；然后將孔板中的培養(yǎng)基更換為新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；將培養(yǎng)基更換為含有puromycin的培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)5 d，直至將所有的未被感染的靶細(xì)胞殺死。將剩余的活細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，待長至2個10 cm皿時，收集細(xì)胞進(jìn)行凍存，同時保留部分細(xì)胞進(jìn)行realtime qPCR和Western blot驗(yàn)證對靶基因的干擾水平。

1.6.6 穩(wěn)定細(xì)胞株驗(yàn)證 (1) qPCR 分別離心收集1×106個knockdown Beclin-1的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染Scrambled control shRNA的細(xì)胞，用Trizol裂解細(xì)胞，提取總RNA。使用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit 制備cDNA樣品。按照表3配置PCR反應(yīng)體系，所用qPCR引物序列信息見表4，PCR反應(yīng)結(jié)束后，獲取樣品Ct值，采用2-ΔΔCt法對結(jié)果進(jìn)行定量。

Tab. 3 Fluorescence quantitative PCR reaction system

Tab. 4 Fluorescence quantification PCR primer sequences

(2) Western blot 分別離心收集1×106個knockdown Beclin-1的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染Scrambled control shRNA的細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，12 000 g、4°C離心10 min，收集上清。向蛋白上清中加入10×的上樣緩沖液，混勻后，100°C煮沸5 min；配置12%的聚丙烯酰胺凝膠，待凝固后，在上樣孔中加入30 μg總蛋白，120 V電泳1.5 h；電泳結(jié)束后，將凝膠從電泳槽中取出，將分離膠切除，通過半干轉(zhuǎn)印方案將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，使用5%的BSA室溫封閉1 h；使用TBST緩沖液洗滌膜三次，每次10 min；使用TBST將Anti-Beclin-1抗體按照1∶1 000比例稀釋后，與PVDF膜共孵育1 h；使用TBST緩沖液洗滌膜三次，每次10 min；使用TBST將HRP標(biāo)記的二抗按照1∶ 5 000的比例稀釋后，與PVDF膜共孵育1 h；使用TBST緩沖液洗滌膜三次，每次10 min；混合化學(xué)發(fā)光底物的A液和B液，滴加到PVDF膜表面后，進(jìn)行曝光顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 慢病毒感染后SH-SY5Y細(xì)胞中GFP的表達(dá)

細(xì)胞感染慢病毒24 h后，熒光顯微鏡下觀察可見大量綠色熒光顆粒，細(xì)胞表達(dá)GFP蛋白。與同一視野下明場相比，表達(dá)GFP細(xì)胞超過80%(圖1)。

Fig.1Expression of GFP after lentiviral infection in SH-SY5Y cells (× 100)

2.2 慢病毒有效抑制目的基因Beclin-1的mRNA及蛋白表達(dá)

熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，Beclin-1 shRNA 1組Beclin-1mRNA表達(dá)(0.096±0.009)明顯低于Beclin-1 Scrambled control 1組(P<0.01)；Beclin-1 shRNA 2組Beclin-1mRNA表達(dá)(0.197±0.021)明顯低于Beclin-1 Scrambled control 2組(P<0.01，圖2A)。提示慢病毒LV Beclin-1 shRNA1和2均可有效抑制Beclin-1基因的表達(dá)。

Western blot結(jié)果顯示，Beclin-1 shRNA 1組蛋白相對表達(dá)水平(0.127±0.017)顯著低于Beclin-1 Scrambled control 1組(P<0.01)；Beclin-1 shRNA 2組蛋白表達(dá)水平(0.156±0.013)顯著低于Beclin-1 Scrambled control 2組(P<0.01, 圖2B，C)。說明慢病毒LV Beclin-1 shRNA1和2均可有效抑制Beclin-1蛋白的表達(dá)。

A: The expression of Beclin-1 mRNA by RT-PCR; B: Western blot was used to detect the expression of Beclin-1 protein; C: The expression of Beclin-1 protein

**P<0.01vsscrambled control group

2.3 沉默Beclin-1基因?qū)H-SY5Y細(xì)胞活力的影響

CCK-8法檢測結(jié)果以空白對照細(xì)胞(Blank Control)組存活率為100.0%，則陰性對照細(xì)胞(Negative Control)，shRNA細(xì)胞組存活率分別為 98.6%±3.4%、97.9%±2.7%。Negative Control組、shRNA組與Blank Control組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 沉默Beclin-1基因?qū)Φ脱跽T導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染Beclin-1shRNA后, Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：(1)BC、NC細(xì)胞的5%O2組Beclin-1蛋白的相對表達(dá)量分別為1.057± 0.037、1.122±0.032，均明顯高于相應(yīng)的21% O2組(P<0.01)；Beclin-1shRNA細(xì)胞的5%O2組蛋白相對表達(dá)量為0.028±0.003，明顯低于NC細(xì)胞的5%O2組(P<0.01)；(2)BC、NC細(xì)胞的5%O2組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值分別為2.186±0.113、2.762± 0.102，均明顯高于相應(yīng)的21% O2組(P<0.01)；Beclin-1shRNA細(xì)胞的5%O2組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值為 0.686±0.048，高于相應(yīng)的21%O2組(P<0.05)且明顯低于NC細(xì)胞的5%O2組(P<0.01，圖3)。

Fig.3Effect of Beclin-1 shRNA on autophagy-related proteins in SH-SY5Y cells induced by hypoxia (x±s，n=3)

A: Western blot was used to detect the expression of Beclin-1 and LC-3 proteins; B: The expression of Beclin-1 protein; C: The expression of LC-3 protein

*P<0.05 ,**P<0.01vs21%O2group；##P<0.01vs5%O2group of NC

2.5 沉默Beclin-1基因?qū)Φ脱跽T導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞自噬小體的影響

電鏡觀察，NC 21%O2組SH-SY5Y細(xì)胞胞漿可見豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和形態(tài)正常的線粒體，少見自噬體出現(xiàn)；NC 5%O2組細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量的雙層膜囊泡結(jié)構(gòu)，內(nèi)含細(xì)胞器和胞漿成分，即自噬體；Beclin-1shRNA細(xì)胞 5%O2組胞漿內(nèi)出現(xiàn)少量的雙層膜囊泡結(jié)構(gòu)。(圖4 箭頭所指即為自噬小體)

Fig.4Observation of autophagosomes by transmission electron microscopy. Arrows refer to autophagosomes (×1 200)

3 討論

慢病毒是一種以人類免疫缺陷病毒-1(human immunodeficiency virus-1, HIV-1)為基礎(chǔ)構(gòu)建的新型載體系統(tǒng)，因其對分裂期和非分裂期細(xì)胞均有很高的轉(zhuǎn)染效率，廣泛應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)染和基因治療等[2]。shRNA在利用慢病毒為載體時，shRNA可整合到細(xì)胞基因組中。shRNA在細(xì)胞內(nèi)通過一系列酶的作用后，通過堿基互補(bǔ)配對，以序列特異性的方式結(jié)合到靶mRNA，從而抑制靶基因的表達(dá)[3]，shRNA在體內(nèi)抑制靶基因的表達(dá)具有很高的特異性[4]。polybrene是一種陽離子聚合物，可以促進(jìn)慢病毒包膜與細(xì)胞膜的相互作用，協(xié)助慢病毒對細(xì)胞膜的感染過程[5]。本實(shí)驗(yàn)在polybrene協(xié)助下以MOI=20進(jìn)行感染，結(jié)果證實(shí)(圖2)，Beclin-1 LV shRNA1和2均可有效抑制Beclin-1mRNA和蛋白的表達(dá)(P<0.01)；但是shRNA2的細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，收集樣品檢測發(fā)現(xiàn)其對細(xì)胞的增殖有影響，因此最終選用shRNA1建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。

自噬(autophagy)是指細(xì)胞在自噬相關(guān)基因(autophagy related gene，Atg)的調(diào)控下，清除細(xì)胞內(nèi)少量受損的細(xì)胞器(如線粒體等)和生物大分子(如蛋白質(zhì)等)，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境自身穩(wěn)定的一種溶酶體依賴的降解途徑[6]。自噬廣泛存在于真核細(xì)胞中[7]，大多數(shù)研究證實(shí)一定程度自噬的增強(qiáng)對維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定意義重大[8, 9]，在低氧、饑餓、應(yīng)激等多種刺激條件下自噬被激活[10]。自噬過程包括自噬的誘導(dǎo)；自噬體組裝成形；自噬體的運(yùn)輸、與溶酶體融合；自噬體的降解[11]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3/Atg8)即是自噬體膜上的標(biāo)記蛋白。細(xì)胞內(nèi)存在兩種形式的LC3蛋白：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，LC3蛋白在合成后其C端即被Atg4蛋白酶切割變成 LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ散在分布于細(xì)胞漿內(nèi)。當(dāng)自噬體形成后，LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)偶聯(lián)形成 LC3-Ⅱ，并定位于自噬體內(nèi)膜和外膜，而且LC3-Ⅱ 始終穩(wěn)定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合，因此被用來作為自噬體的標(biāo)記，且LC3-Ⅱ的水平在某種程度上反映了自噬體的數(shù)量[12]。

Beclin-1是自噬基因，其為自噬的直接執(zhí)行者[13]。Beclin-1蛋白除了接受自噬信號，還可接受很多其它信號對自噬進(jìn)行調(diào)節(jié)，Beclin-1可能是自噬的“守門人”，成為人工干預(yù)自噬活性的靶點(diǎn)[14,15]。低氧是激活自噬的誘因之一[16]，Beclin-1介導(dǎo)的自噬途徑在低氧誘導(dǎo)的自噬中起著關(guān)鍵的作用，但它并不是調(diào)節(jié)自噬的唯一通路[17]。本實(shí)驗(yàn)通過慢病毒介導(dǎo)Beclin-1 shRNA轉(zhuǎn)染入SH-SY5Y細(xì)胞，特異性并長期穩(wěn)定地抑制SH-SY5Y細(xì)胞Beclin-1表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)沉默Beclin-1基因?qū)H-SY5Y細(xì)胞的活力無影響；但是可以明顯降低5%低氧誘導(dǎo)的自噬(圖3、4)。得出結(jié)論：Beclin-1在5%低氧誘導(dǎo)的自噬中扮演重要角色。