◎ 許再元

（中國廣州分析測試中心，廣東 廣州 510070）

雙歧桿菌是一種厭氧的革蘭氏陽性桿菌，由于其對人體有諸多好處，如預防腹瀉，減少便秘，抗過敏、抗腫瘤、調(diào)整腸道功能及改善營養(yǎng)等，常作為一類體外攝入的活性菌添加到許多不同的食品中。對于雙歧桿菌的分離與鑒定方面的研究也隨著其作用的不斷發(fā)現(xiàn)得到了應有的重視和發(fā)展。從1899年法國學者Tissier從母乳營養(yǎng)兒的糞便中分離出雙歧桿菌開始，雙歧桿菌已發(fā)現(xiàn)有32個亞型[1]。其鑒定的手段也從簡單的形態(tài)學上的描述鑒定發(fā)展到構(gòu)建了現(xiàn)代科學的分子進化樹[2]。本文嘗試通過簡單的商業(yè)化API試劑條對6種雙歧桿菌進行鑒定。

1 材料與方法

①試驗中用到的標準菌株：長雙歧桿菌（ATCC15707）、短雙歧桿菌（ATCC15700）、青春雙歧桿菌（ATCC15703）、嬰兒雙歧桿菌（ATCC15697）、動物雙歧桿菌（CICC6165）。②試驗中菌株的復蘇培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基為商業(yè)化的MRS培養(yǎng)基，主要成分及配制方法：蛋白棟10.0 g，牛肉粉5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫80 1.0 mL，磷酸氫二鉀2.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸三2.0 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，瓊脂粉15.0 g。將上述成分加入1 000 mL蒸餾水中，加熱溶解，校正pH 6.2后分裝，121 ℃高壓滅菌15 min[4]。③生化鑒定使用商業(yè)化的API20A與API50CH試劑條。

2 試驗過程

實驗過程與最終鑒定標準參照GB 4789.34-2016。為了保證菌株的活性和穩(wěn)定性，先將菌株在MRS培養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng)劃線分離復蘇培養(yǎng)一代，再分別按照說明書使用API20A與API50CH試劑條配備的培養(yǎng)基（API50CH使用的是API50CHL培養(yǎng)基）配制菌液進行試劑條的加樣，并將添加好試劑的試劑條放于厭氧罐中，在36 ℃下培養(yǎng)。

3 試驗結(jié)果觀察

實驗條每24 h觀察一次并記下結(jié)果，直到生化反應試劑條顏色不再改變，其結(jié)果如下。

3.1 API20A結(jié)果

反應24 h后滴加BCP的結(jié)果基本不再改變。所有的菌株測試結(jié)果輸入數(shù)據(jù)庫中皆能鑒定出為雙歧桿菌屬。分別落在其數(shù)據(jù)庫分類的雙歧桿菌屬一類與雙歧桿菌屬二類中。根據(jù)數(shù)據(jù)庫反饋的結(jié)果并不能將菌株鑒定到種。雖然，數(shù)據(jù)庫分類結(jié)果提示試驗還能通過附加試驗——牛奶消解試驗、淀粉分解試驗、β-GP試驗等，進一步進行種的分類，但最終只能鑒定出其中的3種雙歧桿菌種。

3.2 API50CH結(jié)果

反應24 h后開始觀察并記錄結(jié)果，每24 h觀察記錄一次。由于API50CH試劑條設計為乳桿菌的鑒定，其數(shù)據(jù)庫中并不能將結(jié)果鑒定為雙歧桿菌。所以，本實驗參考了國家標準GB4789.34-2016里雙歧桿菌鑒定的生化鑒定結(jié)果進行人工鑒定對比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，API50CH試驗所得的結(jié)果并不能與國家標準鑒定結(jié)果對應，盡管結(jié)果只代表90%的菌株情況，在后續(xù)沒有其他實驗指標的支撐下，最終難以得到讓人信服的結(jié)果。而且，在試驗觀察中，API50CH中的某些反應緩慢陽性需要等待長達5 d才能趨于穩(wěn)定不再改變，無形中對試驗的鑒定結(jié)果時效性產(chǎn)生了重要影響。

4 結(jié)果與討論

API鑒定系統(tǒng)對于這6株菌株在屬水平上的鑒定是可以肯定的，但在種上的鑒定仍未能完善和涉及，這與雙歧桿菌生化反應的多變特殊性不無關系。其中，多種糖發(fā)酵生化反應涉及緩慢發(fā)酵的情況，往往對結(jié)果的判斷影響較大。因此，不能簡單地以陽性陰性一刀切的方式進行判斷，但是一旦將反應時間延長，一些環(huán)境因素引起的不確定性又會降低判定的準確性。現(xiàn)在國際上并沒有統(tǒng)一通行的雙歧桿菌鑒定方式，特別在生化反應這一方面，雙歧桿菌在種與種之間也沒有特殊肯定的反應鑒別特點，這無疑成為在只使用生化反應對雙歧桿菌鑒定到種的情況難以得到滿意結(jié)果的原因[5-7]。

當然，使用最有效的分子手段，對菌株的關鍵遺傳信息進行測序，是現(xiàn)今細菌鑒定最為認可、準確和直接的手段[1]。但這又往往對實驗室與實驗人員以及成本與檢測時間有特殊的要求，目前的條件難以普及和做到實效。

另外，筆者認為，在日常的食品檢測中，對雙歧桿菌的鑒定要鑒定到種的要求是否有必要也值得深思。

[1]周芳燁，梁國光，劉吉成.雙歧桿菌種類鑒定的基因?qū)W方法[J].齊齊哈爾醫(yī)學院學報，2006，27（9）：1088-1089.

[2]劉 洋，張清平，段文鋒.雙歧桿菌分子分型鑒定研究進展[J].中國乳品工業(yè)，2014，42（5）：43-47.

[3]張 勤，羅 燕，楊爾哈，等.雙歧桿菌分離鑒定的方法及其應用[J].畜牧與飼料科學，2010，31（3）：10-13.

[4]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，國家食品藥品監(jiān)督管理總局.GB4789.35-2016食品安全國家標準食品微生物學檢驗 雙歧桿菌檢驗[S].北京：國家標準出版社，2016.

[5]Martinez R C R，Wachsman M，Torres N I，et al. Biochemical, antimicrobial and molecular characterization of a noncytotoxic bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum, ST71KS[J].Food Microbiology，2013，34（2）：376-381.

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[7]Bune?ová V，Vlková E，Killer J，et al.Identification of Bifidobacterium strains from faeces of lambs[J].Small Ruminant Research，2012，105（1-3）：355-360.