李慶慶，廖福朋，桂先革，黃江鴻，王大平

大面積骨缺損可由創(chuàng)傷、腫瘤、感染及先天發(fā)育不良等所致，是骨科常見的疾病，也是治療的難題。目前的人工骨材料難以有效治療大面積的骨缺損。通過整合骨材料、成骨干細(xì)胞及成骨活性因子等提高人工骨材料的成骨活性是目前骨組織生物工程的研究重點(diǎn)[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）作為種子細(xì)胞，在骨修復(fù)與重建中可分化為成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，促進(jìn)骨愈合[2]。Runx-2在成骨分化的信號(hào)途徑中起核心作用，能誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞定向分化并成熟，從而促進(jìn)骨愈合[3-4]；納米羥基磷灰石（nano HA）是目前應(yīng)用廣泛的一種生物活性材料，具有良好的骨傳導(dǎo)性和生物相容性。本實(shí)驗(yàn)利用重組Runx-2基因的慢病毒感染 BMSCs，將Runx-2BMSCs與nano HA共培養(yǎng)，并用于兔橈骨骨缺損模型，研究 Runx-2 BMSCs-nano HA成骨活性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑、儀器Runx-2慢病毒表達(dá)質(zhì)粒、nano HA人工骨由深圳市第二人民醫(yī)院組織工程實(shí)驗(yàn)室制備提供；人胚腎細(xì)胞（293T細(xì)胞）、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（NCI-H1299）購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；新西蘭大白兔由深圳市疾病預(yù)防控制中心提供；慢病毒包裝系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)GeneCopoeia廣州復(fù)能基因有限公司；Anti-CD90/FITC，Anti-CD105/FITC，PCR試劑盒、番紅、蘇木精及快綠購(gòu)于Sigma公司；DMEM-HG、MEM、LB液體培養(yǎng)基、RPMI-1640、雙抗、FBS、噻唑藍(lán)及二甲基亞砜購(gòu)于GIBCO公司；CO2孵育箱(Thermo公司，美國(guó))；倒置相差顯微鏡（Lecia公司，德國(guó)）、熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)；PCR擴(kuò)增儀(Thermo公司，美國(guó))；凝膠成像系統(tǒng)（Lifetech公司，美國(guó)）。

1.2方法

1.2.1Runx-2慢病毒的包裝、滴度檢驗(yàn)將 Runx-2慢病毒載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行Runx-2慢病毒的重組、擴(kuò)增與純化。重組的慢病毒感染H1299細(xì)胞，計(jì)算出獲得病毒液的滴度（MOI），MOI=平均熒光數(shù)×細(xì)胞總數(shù)/實(shí)際添加的病毒液體積（ml），其中前期實(shí)驗(yàn)中確定MOI值為50。

1.2.2兔BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定將2個(gè)月齡新西蘭大白兔用10%水合氯醛腹腔麻醉，麻醉成功后備皮、消毒、鋪巾，用預(yù)混肝素的穿刺針在股骨中上段多點(diǎn)行骨髓穿刺。穿刺液用PBS液進(jìn)行洗滌、離心，細(xì)胞懸液加入DMEM高糖培養(yǎng)基（含胎牛血清10%，雙抗1%）培養(yǎng)24 h后輕柔洗去懸浮細(xì)胞；48h后再次沖洗懸浮細(xì)胞。待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底后用0.25%胰酶消化、傳代。鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)特征，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs陽性表面標(biāo)記物CD90和CD105。

1.2.3Runx-2慢病毒轉(zhuǎn)染兔BMSCs取 P3生長(zhǎng)狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)期的BMSCs細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，根據(jù)病毒滴度及MOI值準(zhǔn)確計(jì)算病毒量。實(shí)驗(yàn)組中加入4ml病毒液，對(duì)照組中加入4ml eGFP病毒液，空白組中加入4 ml培養(yǎng)液，培育48 h。

1.2.4Runx-2 BMSCs的鑒定 分別將Runx-2BMSCs，eGFP-BMSCs，BMSCs培育 1周，1周后行 RT-PCR，檢測(cè)Runx-2基因表達(dá)。

1.2.5兔橈骨骨缺損模型制備及植入實(shí)驗(yàn)材料

1.2.5.1制備材料 將nano HA材料裁剪為13 mm×4 mm×4 mm 大小，反復(fù)75%乙醇溶液消毒、PBS沖洗后，將nona HA與BMSCs共培養(yǎng)24 h。取制備的Runx-2 BMSCs離心、重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，將細(xì)胞液種植于制備的 nona HA材料表面，使 Runx-2 BMSCs與nano HA充分復(fù)合，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組（A組）。同法制得eGFP-BMSCs-nano HA為B組，BMSCs-nano HA為C組。

1.2.5.2動(dòng)物模型制作 取40只健康6個(gè)月齡新西蘭大白兔，隨機(jī)分為A組、B組、C組及空白組。予10%水合氯醛腹腔麻醉，麻醉成功后，常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，橈骨中段做縱行切口，直至骨膜，用線鋸截骨制成約15 mm橈骨骨缺損模型，同時(shí)去除依附骨膜及周邊骨膜，并分別植入Runx-2 BMSCs-nano HA（A組），eGFP-BMSCs-nano HA（B 組），BMSCsnano HA（C組），空白組不植入材料，皮膚全層縫合，無菌敷貼覆蓋。分籠飼養(yǎng)，自由活動(dòng)。觀察兔的狀態(tài)及傷口愈合情況。分別于術(shù)后4、8及12周分別對(duì)手術(shù)部位行X線檢查。術(shù)后12周空氣栓塞法處死實(shí)驗(yàn)兔，完整取出橈骨標(biāo)本，甲醛固定后制備病理切片，行HE染色觀察骨缺損恢復(fù)情況。

2　結(jié)果

2.1慢病毒滴度檢驗(yàn)（熒光法） 熒光顯微鏡下，每孔隨機(jī)抽取10個(gè)視野范圍，數(shù)出熒光細(xì)胞數(shù)。測(cè)得Runx-2慢病毒滴度為4.8×109TU/ml，F(xiàn)組為空白對(duì)照組，熒光顯微鏡下未發(fā)現(xiàn)綠色熒光細(xì)胞（封三彩圖2）。

2.2兔BMSCs的鏡下形態(tài) 重懸浮后鏡下可見大量圓形懸浮細(xì)胞。24h培養(yǎng)后，部分細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng)，仍有大量細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，PBS液輕柔洗去懸浮細(xì)胞；72 h后貼壁細(xì)胞呈梭形、多角形，有偽足，呈集簇生長(zhǎng)；P3細(xì)胞形態(tài)趨于穩(wěn)定，可呈長(zhǎng)梭形、紡錘形，細(xì)胞分布均勻，無集簇生長(zhǎng)現(xiàn)象（封三彩圖3）。

2.3BMSCs流式細(xì)胞儀鑒定 取 P3 BMSCs進(jìn)行細(xì)胞鑒定。選用BMSCs較特異的抗原CD90、CD105作為鑒定抗原。兩者抗原陽性率分別為 99.4%、99.2%，均超過 99%。鑒定結(jié)果符合BMSCs特征（封三彩圖4）。

2.4Runx-2BMSCs細(xì)胞Runx-2基因的表達(dá) Runx-2慢病毒感染BMSCs1周，可見 Runx-2 BMCSs組 Runx-2表達(dá)較強(qiáng)，而eGFP-BMSCs及BMSCs組均未見明顯Runx-2基因表達(dá)（封三彩圖5）。

2.5實(shí)驗(yàn)兔的形態(tài) 實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后 1周內(nèi)活動(dòng)減少，1周后逐步恢復(fù)活動(dòng)能力，傷口輔料少許滲血，1周后拆線，未見實(shí)驗(yàn)兔傷口感染、壞死，實(shí)驗(yàn)兔死亡等情況。術(shù)后12周A組橈骨骨缺損已被正常骨所取代，表面連接平整，質(zhì)地堅(jiān)韌，未見軟組織長(zhǎng)入；B、C組可見缺損部位骨材料已完全吸收，骨組織已連接兩端，但原缺損處有部分軟組織長(zhǎng)入，未完全修復(fù)；空白組可見部分新生骨組織形成骨連接，大部分骨缺損處為軟組織替代，剔除軟組織可見愈合僅占橈骨1/3～1/2（封三彩圖6）。

2.6術(shù)后4、8及12周X線表現(xiàn) A組術(shù)后4周 X線表現(xiàn)為復(fù)合材料出現(xiàn)吸收，材料與骨組織間無明顯間隙，過渡區(qū)呈高密度影，表明骨細(xì)胞在復(fù)合材料中礦化；8周時(shí)材料進(jìn)一步降解，可見材料由外向內(nèi)分解吸收，整個(gè)缺損區(qū)域出現(xiàn)高亮影，外側(cè)有骨橋連接；12周時(shí)復(fù)合材料已基本吸收，骨皮質(zhì)連續(xù)，骨髓腔通暢，可見仍有部分骨痂存在。B、C組4周時(shí)可見材料部分吸收，材料與骨組織間出現(xiàn)間隙；8周時(shí)材料逐步降解，部分材料已被骨痂組織所取代，部分材料仍未出現(xiàn)礦化跡象；12周時(shí)仍有少量材料存在于骨組織間隙，骨皮質(zhì)已連續(xù)，但骨痂較多，髓腔未通?？瞻捉M4周時(shí)未見斷端間組織鈣化；8周時(shí)斷端出現(xiàn)增生改變；12周斷端出現(xiàn)硬化跡象，部分皮質(zhì)連續(xù)斷端軟組織未見鈣化形成（封三彩圖7）。

2.7病理觀察 A組：骨皮質(zhì)、骨松質(zhì)形成，分布較規(guī)整，其中可見大量成骨細(xì)胞及部分纖維細(xì)胞，可見骨髓組織，未見nona HA材料。B、C組：未見明顯nona HA材料，可見骨組織、結(jié)締組織及髓腔組織，其中骨組織量少而分布不規(guī)則，內(nèi)可見多量成骨細(xì)胞，可見大量纖維結(jié)締組織。空白組：缺損區(qū)域以纖維結(jié)締組織為主，大量纖維細(xì)胞，未見骨組織長(zhǎng)入（封三彩圖8）。

3　討論

Runx-2在成骨分化的信號(hào)途徑中被認(rèn)為具有核心作用，能夠誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞定向分化，并促成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞成熟，從而促進(jìn)骨愈合[3-4]。在成骨分化的調(diào)節(jié)過程中，有多種活性因子直接參與成骨分化的調(diào)節(jié)，包括 BMP-2、BMP-4、BMP-7，TGF-1、TGF-2及IGF1等，但這些上游信號(hào)因子均與Runx-2存在相互作用，他們通過不同的信號(hào)通路使Runx-2基因表達(dá)上調(diào)，或使Runx-2蛋白磷酸化，調(diào)節(jié)其活性和功能，進(jìn)一步調(diào)節(jié)BMSCs的成骨分化。在本實(shí)驗(yàn)的前期實(shí)驗(yàn)中，已制備Runx-2慢病毒質(zhì)粒，并驗(yàn)證Runx-2重組慢病毒感染BMSCs可調(diào)高BMP-2、OCN、ALP、OPN及osteonectin等成骨活性因子的表達(dá)，說明Runx-2具有促進(jìn)其成骨分化的能力[5]。

支架材料作為干細(xì)胞依附生長(zhǎng)，并植入體內(nèi)的介質(zhì)顯得尤為重要[6]。在既往的實(shí)驗(yàn)中，骨支架材料僅僅被作為工程骨提供結(jié)構(gòu)支持，包括金屬、陶瓷、人工或天然的高分子材料及復(fù)合材料等。這些支架材料最大的問題，就是與種子細(xì)胞的相容性不佳，或是種子細(xì)胞難以依附在其表面；或是種子細(xì)胞不能在其間誘導(dǎo)血管長(zhǎng)入；或是種子細(xì)胞不能在其間形成正常骨組織。本研究選用的支架材料為nano HA，是因?yàn)閚ano HA與人體骨骼的無機(jī)成分相同，具有相當(dāng)好的生物相容性[7]。羥基磷灰石粗糙的表面使BMSCs能夠依附、增殖、遷移；納米級(jí)材料擴(kuò)大了材料的有效表面積，能夠吸附更多的BMSCs；更多的孔徑可以使BMSCs誘導(dǎo)血管長(zhǎng)入。同時(shí)在骨的愈合過程中，nano HA逐漸被吸收，吸收的材料釋放鈣質(zhì)，進(jìn)一步被成骨細(xì)胞所利用，促進(jìn)成骨作用。在本實(shí)驗(yàn)X片中可以看到成骨作用并非由外到內(nèi)，而是內(nèi)外同時(shí)出現(xiàn)成骨現(xiàn)象。可以解釋為在體外nano HA與Runx-2 BMSCs共培養(yǎng)時(shí)已充分接種，同時(shí)大量的孔徑能夠使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入到nano HA內(nèi)部，允許內(nèi)部的BMSCs增殖、分化，并最終成骨[8]。

骨缺損模型的制作也是本研究的難點(diǎn)之一。在實(shí)際醫(yī)療環(huán)境中，需要大面積異體骨移植的患者往往骨缺損較大，軟組織條件較差。而在動(dòng)物模型上難以完全模擬這一情況，因此需要適當(dāng)增大缺損骨面積，去除利于骨愈合的軟組織[9]。本研究選用的是兔橈骨缺損模型，橈骨與尺骨相連，故術(shù)后無需內(nèi)固定亦可正?；顒?dòng)，既簡(jiǎn)化了手術(shù)步驟，也減少了手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，減少了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的損耗[10]。Bighamsadegh等[11]認(rèn)為兔的橈骨缺損模型達(dá)到1～12mm較為合理，而本實(shí)驗(yàn)中將缺損模型定為15 mm，考慮需適當(dāng)加大缺損體積，避免自行愈合可能。同時(shí)，筆者在實(shí)驗(yàn)過程去除缺損段骨膜及上下緣部分骨膜，模擬軟組織缺損情況[12]。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，空白組不能自行愈合骨缺損，說明骨缺損模型是合適的。

盡管nano HA有諸多好處，但強(qiáng)度低、脆性大及不耐疲勞等影響著其在臨床中的應(yīng)用；而骨缺損的患者往往需要更長(zhǎng)的臥床時(shí)間，更長(zhǎng)的非負(fù)重時(shí)間，這在一定程度上減少了nano HA的劣勢(shì)。盡管如此，一種具有良好生物相容性，又具有高強(qiáng)度、可降解的骨材料生物支架是本實(shí)驗(yàn)組后期所需要研究的。

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