白雪晶，馮 磊，徐文波,羅 旋，鄢東海(.昆明醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院，云南省玉溪市人民醫(yī)院，云南 玉溪 65300；.昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650500)

血管內(nèi)皮細胞連續(xù)覆在血管內(nèi)膜，其具有重要的生理功能，廣泛參與了炎性反應(yīng)、血管新生、免疫應(yīng)答、動脈粥樣硬化、血管張力調(diào)節(jié)等生理及病理過程[1]。血管內(nèi)皮細胞功能失調(diào)與許多心血管疾病的發(fā)生有關(guān)，冠心病的發(fā)生與血管內(nèi)皮細胞的損傷與其功能異常有密切的關(guān)系[2]。內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)是研究內(nèi)皮細胞生物學(xué)與多種疾病關(guān)系的重要方法，是目前最簡單可靠的被廣泛運用于生理研究的人類血管細胞。隨著細胞培養(yǎng)技術(shù)不斷進步，文獻報道了一種儀器，使用這種儀器內(nèi)，皮細胞可以從人類的臍靜脈中分離出來而不受污染[3]。但是作為基礎(chǔ)實驗，筆者仍然需要探索一種適用于科研工作者的分離純化HUVECs的方法。

1973年Jaffe等首先報道了內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)的方法[4]，以后人們在此基礎(chǔ)上不斷完善和改進，以獲得性狀穩(wěn)定、純度較高的血管內(nèi)皮細胞，并可較長時間培養(yǎng)(可傳6～10 代)，內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)關(guān)鍵在于獲取、純化。作為HUVECs培養(yǎng)的第一步，細胞的獲取方法對細胞純度及含量至關(guān)重要，在培養(yǎng)細胞的獲取方法上,有酶法和非酶法兩種。

1 細胞獲取方式

1.1非酶法：非酶法主要包括機械刮取、組織塊移植兩種。但是機械刮取方法易損傷細胞，組織塊移植易混雜其他血管壁細胞，近幾年來這兩種方法已較少使用。

1.2酶消化法：這種方法的主要步驟是用酶灌注臍靜脈，收集內(nèi)皮細胞后接種培養(yǎng)。每一個過程都影響著HUVECs的純度和活力。消化時間是關(guān)系到內(nèi)皮細胞活力和純度的重要步驟，消化時間過長，易混入其他雜細胞，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞自臍靜脈脫離后在培養(yǎng)液中較難存活，使細胞純度和細胞活力都下降；反之,消化時間過短,則獲取的細胞較少，經(jīng)過大量研究，消化時間為10～15 min較為理想[5]。而酶是成功的關(guān)鍵步驟，早期探索了三種酶處理臍靜脈、分離內(nèi)皮細胞的方法，不同實驗研究表明，不同的酶有不同的優(yōu)勢，用膠原酶消化的細胞數(shù)最多,平均每根臍帶可獲取(2～5)×106個細胞,但有時混雜少量成纖維細胞；鏈絲菌蛋白酶消化獲取的細胞數(shù)略少于膠原酶,但很少混雜成纖維細胞；胰蛋白酶對細胞有毒性作用,且消化獲取的細胞數(shù)較少,不利于細胞生長[6]。

目前常用的酶主要是胰蛋白酶和膠原酶。大多數(shù)實驗采用的是胰蛋白酶，因為胰蛋白酶較膠原酶價廉易得，能獲得的細胞數(shù)量較多，成活率也較高。劉文等研究表明胰酶消化法能夠獲得大量且純度高的HUVECs[7]。近幾年國內(nèi)外的研究者也常選用膠原酶，包括Ⅰ型膠原酶和Ⅱ型膠原酶，Ⅰ型膠原酶運用較廣泛，運用Ⅱ型膠原酶也能成功獲取足量細胞。羅銳等通過實驗得出結(jié)論，他們發(fā)現(xiàn)選用Ⅰ型膠原酶作為血管內(nèi)皮細胞分離酶，與其他酶(胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶)相比，消化效率適當(dāng)，細胞量較多，結(jié)構(gòu)較為完整，且細胞成團生長，容易存活[8]；但是陳小翠等人采用Ⅱ型膠原酶灌注消化人臍靜脈，也獲得了高純度、高活性的臍靜脈內(nèi)皮細胞[9]。也有研究表明，Ⅰ型膠原酶消化分離獲得的HUVECs純度高、活力強,而胰蛋白酶消化分離HUVECs可以降低非內(nèi)皮細胞的貼壁能力，因此,二者混合消化是一種經(jīng)濟且實用的獲取HUVECs的方法[10]。

2 臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)

HUVECs 是一種低增殖能力的細胞，體外生長能力較差，增殖緩慢，因此人臍靜脈內(nèi)皮細胞的原代培養(yǎng)要注意以下幾點：內(nèi)皮細胞通常需要加入高濃度(20%)的胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和內(nèi)皮細胞生長添加劑(endothelial cell growth supplement，ECGS)才能滿足其生長需要。目前，較常用的培養(yǎng)基是M199培養(yǎng)基，含有10%～20%的FBS及ECGS，但是BalaK等人的研究發(fā)現(xiàn)[11]，在含高濃度FBS( 200ml/L) 的M199培養(yǎng)基中添加內(nèi)皮細胞生長因子仍不能滿足臍靜脈內(nèi)皮細胞生長需求，而且這種培養(yǎng)基還存在一些問題，如由于血清濃度過高，細胞容易老化，傳代的代數(shù)較少，不利于后續(xù)實驗的進展，同時FBS中含有各種不同含量的生長因子，是否需要加入的生長因子以及加入的量難以把握[12]。也有研究通過加入一定濃度的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)或堿性成纖維因子( basic fibroblast growth factor，bFGF)[13]來促進血管內(nèi)皮細胞的增殖，但是生長因子價格昂貴，難以推廣使用。而且加入細胞因子對于繼續(xù)研究可能有干擾作用，在冠心病形成諸多的參與因子中，VEGFs和bFGF等因子是調(diào)節(jié)新生血管成熟的重要生長因子，李海云等人的研究表明，冠心病心肌缺血越嚴(yán)重，血清VEGF的含量越高[14]；也有研究表明，人血清中bFGF增高可能是冠心病發(fā)生的新型風(fēng)險因子[15]，而人臍靜脈內(nèi)皮細胞最常用于心腦血管疾病的研究，這容易對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響，所以經(jīng)過不斷探索，最近許多研究使用內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基(Endothelial Cell Medium，ECM),其成分固定,且FBS濃度僅為5%，ECGS為1%。這種培養(yǎng)基培養(yǎng)的原代內(nèi)皮細胞形態(tài)好，死細胞較少，且傳代后貼壁率高，ECM 培養(yǎng)基能夠選擇性的促進人微血管內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)中的增殖和生長，并為其達到最理想營養(yǎng)平衡狀態(tài)[16]。另外，細胞培養(yǎng)在原代、傳代時營養(yǎng)液一般都需要添加血清，選擇高質(zhì)量的血清是細胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，較常用的血清有胎牛血清、新生牛血清、人血清等，目前較常用的是胎牛血清。

3 臍靜脈內(nèi)皮細胞的鑒定

不同器官和組織起源的內(nèi)皮細胞在細胞形態(tài)、基因表達、表型和功能特性等方面都不相同，鑒別內(nèi)皮細胞的方法有多種，主要是依據(jù)顯微鏡下形態(tài)學(xué)特征、特異性抗原的表達來鑒別的。

3.1形態(tài)學(xué)觀察：倒置相差顯微鏡可以初步鑒別，研究發(fā)現(xiàn)[17-18]，臍靜脈內(nèi)皮細胞貼壁單層生長,初為圓形、橢圓性或團塊狀，后逐漸呈短梭狀或鋪路石樣鑲嵌排列，細胞為扁平多角形，邊界清楚，胞核清晰可見，呈圓形或橢圓形。HE 染色胞核呈藍色、卵圓形，位于中央，大而不規(guī)則，可見明顯的核仁，胞質(zhì)均勻，胞質(zhì)呈粉紅色，胞膜較清楚，胞漿豐富。根據(jù)培養(yǎng)條件的差異，細胞貼壁的時間稍有差別，接種數(shù)小時(2～6 h不等，多為2～3 h)后開始貼壁，1 d左右貼壁完全，1～2周左右可匯合成片；傳代細胞生長旺盛，通常1 h左右開始貼壁，3～7 d可匯合成片，細胞分布均勻，邊界清楚，細胞核有時呈雙核或多核[19]。

3.2免疫組織化學(xué)染色：僅依靠形態(tài)學(xué)來鑒別內(nèi)皮細胞是不夠準(zhǔn)確的，可結(jié)合細胞免疫化學(xué)法來鑒定內(nèi)皮細胞，Ⅷ因子是血管內(nèi)皮細胞的特征性標(biāo)志之一，目前鑒定HUVECs最有效的方法是檢測Ⅷ因子相關(guān)抗原。Ⅷ因子的穩(wěn)定性和半衰期取決于VWF(von Willebrand factor)，因此VWF相關(guān)抗原免疫組化可以用來鑒定HUVECs，該方法簡單易行。通常采用兔抗人或鼠抗人作為一抗，二抗的來源廣泛，常用酶標(biāo)二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG)，經(jīng)過染色后，顯微鏡下觀察攝片，陽性反應(yīng)可見內(nèi)皮細胞呈圓形、梭形或多邊形，胞漿內(nèi)可見棕黃色顆粒，核周密集。有研究發(fā)現(xiàn)[20]，Ⅷ因子連同VWF共同儲存在weibel- palade body(W-P小體)中,W-P小體等特異性物質(zhì)可以進行鑒定，透射電鏡下內(nèi)皮細胞核膜清晰,胞漿內(nèi)多微絲、微管結(jié)構(gòu),在少數(shù)細胞核周的胞漿可見內(nèi)皮細胞所特有的桿狀小體W-P小體，其為質(zhì)膜包裹,內(nèi)有微管樣結(jié)構(gòu)。但不是所有細胞都有W-P小體，因此不能作為常規(guī)鑒定的標(biāo)志物。

還有其他化學(xué)染色法可以鑒別內(nèi)皮細胞，但是不常用于HUVECs的鑒定，分泌一氧化氮是內(nèi)皮細胞的重要功能，Western blotting檢測內(nèi)皮細胞標(biāo)志酶-一氧化氮合酶的含量也可以用來鑒定內(nèi)皮細胞，但是由于這些方法檢測的是內(nèi)皮細胞的共性，對于鑒別HUVECs特異性不高，不能作為常規(guī)檢測方法。早期有研究采用抗VWF因子抗體免疫熒光標(biāo)記對HUVECs進行鑒定，攝取乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL)和吸附Ⅰ型荊豆凝集素(UEA-1)的細胞功能檢測也被用做特異性的鑒定內(nèi)皮細胞的方法，劉長樂等人實驗結(jié)果顯示[21]：Dil-Ac-LDL(熒光標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白)發(fā)紅色熒光，熒光強度高；FITC-UEA-1(異硫氰酸熒光素標(biāo)記的Ⅰ型荊豆凝集素)發(fā)綠色熒光，熒光強度高；雙熒光陽性百分比較高；胞核呈藍色熒光，有可參考性。

3.3細胞純度檢測：鑒定內(nèi)皮細胞表型常用的抗原標(biāo)記包括CD34、CD144。有研究表明，自從Fina等發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞有CD34的基因表達[22]后,常被用來標(biāo)記血管內(nèi)皮細胞，CD34表達強于Ⅷ因子，它被認(rèn)為是目前血管內(nèi)皮細胞最可靠的標(biāo)記，可進行免疫組織化學(xué)染色，但目前較常用的是流式細胞術(shù)，流式細胞術(shù)。CD144為內(nèi)皮細胞特異性標(biāo)志，常用檢測方法有免疫細胞化學(xué)法、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測及Western blot檢測法。張清等實驗結(jié)果顯示[23]CD144免疫細胞化學(xué)陽性細胞，染色表現(xiàn)為細胞膜附著棕黃色顆粒；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測人臍靜脈內(nèi)皮細胞目的基因CD144有較強表達；Western blot檢測傳代的人臍靜脈內(nèi)皮細胞，顯示高表達CD144。

近年來也有人用CD31[24]、sCD54[25]、CD105、 VEGFR[26]來對內(nèi)皮細胞進行鑒定。VWF、Ⅰ型荊豆凝集素(UEA-1)結(jié)合率也可用流式細胞儀來檢測，以鑒定內(nèi)皮細胞的純度。

3.4細胞增殖檢測：MTT法 人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖能力可以反應(yīng)細胞的活力，在一定時間內(nèi)，隨著培養(yǎng)時間增加，內(nèi)皮細胞明顯增殖加快，有實驗結(jié)果表明[27]，HUVECs接種后1 d細胞計數(shù)略有減少，2 d開始生長，但生長速度較慢；3～7 d生長速度加快,維持在對數(shù)生長期；8 d起細胞發(fā)生接觸抑制，進入停滯期，細胞倍增時間為72 h。

3.5凍存后復(fù)蘇后管腔形成實驗：凍存后 HUVECs仍然具有成管能力，管腔結(jié)構(gòu)的完整性，管腔大小以及管腔壁厚度與凍存前細胞所形成的管腔無明顯差別。有實驗結(jié)果顯示，在內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，HUVECs 呈較好的運動和分化狀態(tài)，培養(yǎng)24 h后在細胞外基質(zhì)膠 Matrigel 上可見類似于毛細血管的完整閉合管腔形成[12]，說明凍存后細胞仍能維持內(nèi)皮細胞的功能，標(biāo)準(zhǔn)凍存后對 HUVECs的功能無明顯影響。

4 展望

隨著高血壓，冠心病等血管性疾病發(fā)病率增高，與血管內(nèi)皮細胞功能的研究成為熱點，目前體外培養(yǎng)的HUVECs是最重要也是最常見的研究心血管疾病的工具細胞，包括原代HUVECs和HUVECs細胞株兩種，HUVECs細胞株種類比較多，多數(shù)是與癌細胞雜交獲得的，培養(yǎng)要求低，可以無限傳代。一般用于心血管疾病研究的是ECV304、EA.hy926。相對于HUVECs細胞株，原代細胞培養(yǎng)要求較高，但是由于其材料易于獲得，所獲得的實驗結(jié)果較符合人體情況，生物學(xué)特性更典型，易于鑒別，有利于后續(xù)實驗研究，研究者可以根據(jù)自身實驗要求進行選擇。

與動物細胞相比，HUVECs 更接近人體生理狀態(tài)；而與人體動脈內(nèi)皮細胞相比，HUVECs 取材經(jīng)濟、操作簡便，且具有與動脈內(nèi)皮細胞生物學(xué)特征相似的優(yōu)點，運用更加廣泛，為進一步研究血管內(nèi)皮細胞的生物學(xué)特性以及其與各種疾病的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。本文總結(jié)了臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)常見的分離、培養(yǎng)、鑒別方法，但是目前仍然存在一些問題，目前已經(jīng)經(jīng)過了多種探究，但是仍然沒有統(tǒng)一的可實施的標(biāo)準(zhǔn)，還需要不斷探索，總結(jié)出一套使HUVECs培養(yǎng)效率高、純度好，且簡單易行，能穩(wěn)定地運用于血管相關(guān)疾病研究的細胞培養(yǎng)方法。

5 參考文獻

[1] Siow R C.Culture of human endothelial cells from umbilical veins[J].Methods MolBiol，2012，806:265.

[2] 李紅昆，陸永光.內(nèi)皮細胞微粒與冠心病關(guān)系的研究進展[J].廣西醫(yī)學(xué)，2013，35(1):104.

[3] Lei J，Peng S，Samuel S B，et al.A simple and biosafe method for isolation of human umbilical vein endothelial cells[J]. Analytical Biochemistry，2016，508:15.

[4] Jaffe E A，Nachman R L，Becker C G，et al.Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins.Identification by morphologic and immunologic criteria[J].Journal of Clinical Investigation，1973，52(11):2745.

[5] Qin Y X，Wu Z M，Xu Q，et al.Effects of serum starvation on cell cycle synchronization in primary human umbilical vein endothelial cells[J].Nan fang yi ke da xue xue bao = Journal of Southern Medical University，2016，36(8):1140.

[6] 卞杰勇,周 岱.人臍靜脈內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)的影響因素[J].中國細胞生物學(xué)學(xué)報，1997,19(2):66.

[7] 劉 文，陳瑞云，王志偉.原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)方法經(jīng)驗總結(jié)[J].中國醫(yī)學(xué)工程，2016，26(8):11.

[8] 羅 銳，胡如印，汪 健,等.原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)及鑒定[J].中華臨床醫(yī)師雜志:電子版，2016，(11):14.

[9] 陳小翠，陳邦黨，楊毅寧,等.人臍靜脈內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)和鑒定[J].細胞與分子免疫學(xué)雜志，2016，32(3):328.

[10] 劉洋洋，冉林武，范學(xué)文,等.人原代臍靜脈內(nèi)皮細胞體外模型的建立及鑒定[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2016，38(2):223.

[11] Bala K，Ambwani K，Gohil N K.Effect of different mitogens and serum concentration on HUVEC morphology and characteristics：implication on use of higher passage cells[J].Tissue & Cell，2011，43(4):216.

[12] 蔡維霞，梁 亮,計 鵬,等.人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)的方法研究[J].中國修復(fù)重建外科雜志，2011,25(2):139.

[13] Kitamura N，Hasebe T，Matsumoto T，et al.Basic fibroblast growth factor as a potential stent coating material inducing endothelial cell proliferation[J].Journal of Atherosclerosis & Thrombosis，2014，21(5):477.

[14] 李海云，逄錦聚.冠心病患者血清BNP、VEGF、hs-CRP檢測的價值評估及研究[J].中外醫(yī)療，2017，36(21):29.

[15] Ivannikova E V，Kalashnikov V Y，Smirnova O M，et al.Risk factors and glycation end products in patients with different forms of coronary heart disease and type 2 diabetes mellitus[J].Ter Arkh，2014，87(10):19.

[16] Du P，Subbiah R，Park J H，et al.Vascular morphogenesis of human umbilical vein endothelial cells on cell-derived macromolecular matrix microenvironment[J].Tissue Engineering Part A，2014，20(17-18):2365.

[17] 崔麗麗，余芳芳，左 麗,等.改良人原代臍靜脈內(nèi)皮細胞的分離及鑒定[J].貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015，40(1):20.

[18] 馬振華，張連杰，馬艷琴.人臍靜脈內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)方法的建立及優(yōu)化[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2015，35(3):285.

[19] Turner N A，Moake J L.Factor VIII Is Synthesized in Human Endothelial Cells，Packaged in Weibel-Palade Bodies and Secreted Bound to ULVWF Strings[J].Plos One，2015，10(10):e0140740.

[20] 閻江洪，吳倩怡，羅素新,等.人臍靜脈內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)及鑒定[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2016，39(5):555.

[21] 劉長樂，鄭心田，李廣平,等.體外人臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)鑒定及抗原表達分析[J].山東醫(yī)藥，2011，51(36):25.

[22] Fina L，Molgaard H V，Robertson D，et al.Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells[J].Blood，1990，75(12):2417.

[23] 張 清，張玲玲.人臍靜脈內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)及其相關(guān)研究[J].醫(yī)學(xué)綜述，2010，16(3):333.

[24] Suhaila R N，Safuan S，Suhaila R N，et al.Isolation Methods and Culture Conditions of Human Umbilical Vein Endothelial Cells from Malaysian Women[J].Sains Malaysiana，2017，46(3):463.

[25] Malara N M，Trunzo V，Musolino G，et al.Soluble CD54 induces human endothelial cells ex vivo expansion useful for cardiovascular regeneration and tissue engineering application[J]. International Journal of Cardiology Heart & Vasculature，2015，6:48.

[26] Zeng R，Jiang X F，Chen Y C，et al.VEGF，not VEGFR2，is associated with the angiogenesis effect of mini-TyrRS/mini-TrpRS in human umbilical vein endothelial cells in hypoxia[J]. Cytotechnology，2014，66(4):655.

[27] 李 悅，楊向紅.生長抑制因子4對內(nèi)皮細胞增殖、遷移及血管形成相關(guān)因子表達的影響[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2017，46(2):160.