(北京大學(xué)人民醫(yī)院藥劑科，北京 100044)

肝臟是人體重要的代謝器官之一，可參與多種生理病理過程[1-6]。在肝臟行使的諸多功能中，肝細(xì)胞發(fā)揮了主要作用，原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞更接近于機(jī)體內(nèi)環(huán)境，因此成為許多體外實(shí)驗(yàn)的選擇，但肝細(xì)胞的分離技術(shù)要求高、原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞增殖能力差，不容易成功。兩步灌流法是分離肝細(xì)胞的經(jīng)典方法[7]，該方法分離得到的細(xì)胞數(shù)量多、存活率及純度也較高，但該方法所需的灌流裝置復(fù)雜，操作技術(shù)要求高，耗時長，而且不適宜小鼠的肝細(xì)胞分離。近年來有文獻(xiàn)報道的Ⅳ型膠原酶消化法分離小鼠肝細(xì)胞，是一種不經(jīng)血液灌流的酶直接消化法[8-9]，該方法簡單易行，但與傳統(tǒng)的灌流法相比，收獲的肝細(xì)胞數(shù)量減少、純度不夠高。因此，建立一種簡單易行、高效的分離培養(yǎng)純化肝細(xì)胞的方法十分重要。本研究采用改良的簡易兩步灌注法分離小鼠肝細(xì)胞，并進(jìn)行原代培養(yǎng)，旨在為肝細(xì)胞相關(guān)課題的研究奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

4～12周齡C57小鼠60只，雌雄不限，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物部提供。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及器材

實(shí)驗(yàn)所用試劑主要包括高糖DMEM(美國HYCLONE公司)；鼠尾膠原(美國MILLIPORE公司)；胎牛血清(FBS，美國GIBCO公司)；Ⅳ型膠原酶(美國GIBCO公司)等。實(shí)驗(yàn)相關(guān)器材主要包括0.45 mm頭皮針、200目尼龍細(xì)胞篩等。

1.3 肝細(xì)胞分離及純化

以3 g/L戊巴比妥鈉10 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉小鼠，為防止麻醉過深致術(shù)中小鼠死亡而使肝臟凝血，可在麻醉后立即腹腔注射0.05 mL肝素；麻醉后固定小鼠，乙醇消毒皮膚，依次剪開皮膚、皮下組織并充分暴露肝門靜脈，肝門處筋膜少無需剝離，經(jīng)肝門靜脈穿線備用；用眼科剪在門靜脈處剪一“V”字形切口，棉球短暫壓迫止血，立即插入頭皮針(連接裝有20 mL灌流液注射器)，動脈夾固定頭皮針，再將已穿好的線結(jié)扎以防頭皮針滑脫；固定頭皮針針頭后，可用鑷子固定灌流管路以防通路扭曲產(chǎn)生氣泡或推注時針頭扭動而刺破門靜脈；緩慢推入D-Hank’s灌流液(無需預(yù)熱，室溫即可)，待肝臟逐漸膨漲并變白時剪斷下腔靜脈使灌流液流出，再夾閉下腔靜脈繼續(xù)推入灌流液，待肝臟再次膨脹后松開夾閉的下腔靜脈使灌流液流出，如此反復(fù)循環(huán)2～3次，可將肝臟內(nèi)的血液灌凈，整個過程約需10 mL灌流液，大約推注5 min；灌流結(jié)束后將注射器里換成預(yù)熱的膠原酶，推注速度略慢，肝臟膨脹后夾閉下腔靜脈，靜止0.5～1.0 min使酶充分發(fā)揮消化作用，再松開下腔靜脈時，肝臟塌陷速度減慢，如此循環(huán)2～4次后肝臟塌陷，表面出現(xiàn)裂痕，有明顯的肝小葉輪廓，此時可停止消化；小心取下肝臟，置入裝有15 mL預(yù)冷DMEM的玻璃皿中漂洗，小心剝除膽囊、結(jié)締組織等成分后；再將肝臟置入另一個裝有15 mL預(yù)冷DMEM的玻璃皿中，將肝臟放在200目細(xì)胞篩上，微微傾斜玻璃皿，用眼科鑷輕輕剝離肝包膜，可見肝臟逐步變?yōu)椤盃€泥狀”，夾住肝門處結(jié)締組織并在篩子上輕輕甩動肝臟，靠篩子的摩擦力將肝細(xì)胞過濾到細(xì)胞篩下面的玻璃皿中，最后再用數(shù)毫升DMEM沖洗篩子上殘余的肝細(xì)胞；將含有細(xì)胞懸液的DMEM液體置入15 mL離心管中，室溫靜止5～8 min，一般可收獲2～4 mL細(xì)胞沉淀，吸掉上清液，加入預(yù)冷的DMEM，重懸細(xì)胞，再次室溫靜止5～8 min以純化細(xì)胞。

1.4 肝細(xì)胞培養(yǎng)

將37 ℃預(yù)熱的完全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS的高糖DMEM)加入到已純化的細(xì)胞沉淀中，重懸細(xì)胞并混勻以進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整肝細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度，按每孔1×106個細(xì)胞接種于鋪有鼠尾膠原的6孔或12孔培養(yǎng)板中，在倒置顯微鏡下動態(tài)觀察細(xì)胞的形態(tài)后，置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h細(xì)胞貼壁后進(jìn)行細(xì)胞換液，用吸量管或槍頭用力吹打細(xì)胞，以將雜質(zhì)吹下。棄培養(yǎng)液，吸凈，直接加入37 ℃預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，以后每24 h換液1次，細(xì)胞可存活10 d以上。

2 結(jié) 果

小鼠肝臟經(jīng)以上改良的簡易兩步灌注法消化后，可獲得分散較好的單個細(xì)胞，每只小鼠獲得的肝細(xì)胞數(shù)量約為2.5×107個，細(xì)胞呈圓形、透明，包膜完整而清晰；取經(jīng)3次洗滌后的肝細(xì)胞懸液加入等量錐蟲藍(lán)染液混合染色數(shù)秒鐘后，滴于玻片，置顯微鏡下行活細(xì)胞記數(shù)，低倍鏡下可見活細(xì)胞呈光亮圓形，飽滿，透光度好，胞核清晰，錐蟲藍(lán)染色觀察，消化后所得的細(xì)胞較少著色，細(xì)胞成活率可達(dá)85%以上。細(xì)胞培養(yǎng)4 h大約90%以上的肝細(xì)胞貼壁(圖1)，貼壁的肝細(xì)胞呈典型的黏附聚集生長，細(xì)胞由貼壁前的圓形轉(zhuǎn)變?yōu)槎噙呅?，胞體變平變薄，明顯增大。胞漿豐富，胞核呈圓形或橢圓形，單核或雙核。細(xì)胞可穩(wěn)定貼壁7～10 d(圖2～3)，貼壁期間細(xì)胞成活率仍大于85%，7～10 d后細(xì)胞陸續(xù)出現(xiàn)脫顆粒、死亡。

除細(xì)胞成活率外，研究還顯示，小鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)到第1、3、5、7和10天時均能夠分泌白蛋白，細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)檢測到的白蛋白的濃度分別為(1.87±0.13)、(1.98±0.32)、(3.45±0.21)、(4.12±0.15)與(3.53±0.19)g/L。結(jié)果表明分離培養(yǎng)的肝細(xì)胞功能良好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 肝細(xì)胞培養(yǎng)4 h后的形態(tài)

圖2 肝細(xì)胞培養(yǎng)7 d后的形態(tài)

圖3 肝細(xì)胞培養(yǎng)10 d后的形態(tài)

3 討 論

原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞是一種應(yīng)用廣泛的細(xì)胞模型，因其更接近體內(nèi)環(huán)境，可更好地模擬體內(nèi)細(xì)胞的功能，常用于藥理學(xué)、分子生物學(xué)等諸多領(lǐng)域的相關(guān)研究[10-16]。本課題組通過長期摸索、反復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)合以往經(jīng)典的二步灌流法[7]和Ⅳ型膠原酶直接消化法，設(shè)計了一種操作簡單、省時、高效的簡易灌注分離小鼠肝細(xì)胞的方法，現(xiàn)將經(jīng)驗(yàn)總結(jié)如下。

3.1 小鼠的選擇

C57是近交系動物，與封閉群相比，個體之間差異小，對實(shí)驗(yàn)反應(yīng)一致，動物品種的具體選擇應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求。小鼠的性別，原則上雌雄不限，但同組實(shí)驗(yàn)，盡量保證性別前后一致，以求實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定。8～10周齡的小鼠是相當(dāng)于成年狀態(tài)，大小合適，低于4周齡的年齡偏小，門靜脈細(xì)，不易插管；高于12周齡的小鼠，年齡偏大。但具體情況應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求而定，根據(jù)本課題組的經(jīng)驗(yàn)，4～12周齡的小鼠都可以采取本方法獲取較多的肝細(xì)胞。

3.2 培養(yǎng)基的選擇

分離肝細(xì)胞時使用的培養(yǎng)液，最好用4 ℃預(yù)冷的DMEM(不含F(xiàn)BS)，因低溫對肝細(xì)胞有保護(hù)作用，最后培養(yǎng)細(xì)胞及換液時所需的培養(yǎng)液，要使用37 ℃預(yù)熱的完全培養(yǎng)液。預(yù)先用“膠原蛋白”處理的培養(yǎng)皿，細(xì)胞貼壁效果更好。

3.3 灌流及消化過程中注意的問題

門靜脈插管和膠原酶消化，是本方法的核心要素。0.45 mm的頭皮針連接上裝有20 mL灌流液的注射器后，首先應(yīng)將管道的氣泡排凈，以防氣泡進(jìn)入肝臟導(dǎo)致灌流不全；將頭皮針的針頭稍微摩鈍，以防插管時將肝門靜脈刺破；用剪刀將頭皮針的針柄剪出劃痕，以增加固定時的摩擦力，防止滑脫。Ⅳ膠原酶應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，使用HBSS液配制，濃度為1 g/L(不同批次膠原酶活力略有差異，濃度一般1 g/L)，使用前，置于37 ℃水浴鍋預(yù)熱30 min～1 h，酶的活力更佳。

3.4 肝細(xì)胞的功能檢測

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)此簡易灌注法分離的小鼠肝細(xì)胞可穩(wěn)定貼壁7～10 d，貼壁期間細(xì)胞存活率可達(dá)85%以上，與傳統(tǒng)方法相似[17]。通過檢測培養(yǎng)液上清中的白蛋白的分泌情況，判斷肝細(xì)胞的生物學(xué)活性和功能，結(jié)果表明本研究分離培養(yǎng)的肝細(xì)胞功能良好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，白蛋白分泌量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而增加，培養(yǎng)至第7天時分泌量達(dá)高峰，隨后逐漸下降，在培養(yǎng)的3～10 d左右為肝細(xì)胞原代培養(yǎng)的最佳實(shí)驗(yàn)階段。成纖維細(xì)胞污染通常是導(dǎo)致肝臟上皮細(xì)胞培養(yǎng)失敗的主要原因，本方法采取的簡易灌注法首先在灌注膠原酶后可使肝臟充分消化；其次在停止消化后，小心剝除膽囊、結(jié)締組織等成份，并將肝包膜撕除干凈，以上措施均可很大程度上防止成纖維細(xì)胞的混雜生長。

綜上所述，這種簡易的灌流方法，與SEGLEN等[7]的方法相比，不需要特殊的復(fù)雜裝置，與王宇明[18]簡易灌流法相比，灌流裝置由輸液管改為注射器，手動推入，更易根據(jù)灌流情況掌控推入速度。此外，本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)還在于收集細(xì)胞時不使用離心法，而采取室溫靜置數(shù)分鐘的方法，筆者對比了離心法和靜置法收集肝細(xì)胞的數(shù)量差異，室溫靜置法收集的肝細(xì)胞數(shù)量明顯高于離心法，可能是由于新分離的肝細(xì)胞較為脆弱，離心法會增加肝細(xì)胞的破損。根據(jù)本課題組的摸索，此方法同樣適用于大鼠肝細(xì)胞的分離及原代培養(yǎng)[19]，更換大號頭皮針、適度增加灌流量、增加酶的消化時間即可，其他步驟同上。原代肝細(xì)胞已成經(jīng)為科學(xué)研究中應(yīng)用越來越廣泛的細(xì)胞模型[20-22]，期望本課題組探索的簡易兩步灌注法分離小鼠肝細(xì)胞，能被更多的實(shí)驗(yàn)室采納應(yīng)用。