李 慧，陳 苗，唐 莉，闞珍珍，李文超，顧有方

（安徽科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100）

近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新的核酸擴(kuò)增技術(shù)不斷涌現(xiàn)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，簡(jiǎn)稱LAMP是利用4個(gè)特殊設(shè)計(jì)的引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶,在恒溫條件下特異、高效、快速地?cái)U(kuò)增DNA的新技術(shù)。該技術(shù)在1h內(nèi)能擴(kuò)增出109靶序列拷貝,擴(kuò)增產(chǎn)物是一系列反向重復(fù)的靶序列構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰萊樣結(jié)構(gòu)的DNA片段的混合物,電泳后在凝膠上顯現(xiàn)出由不同大小的區(qū)帶組成的階梯式圖譜LAMP等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系包含了內(nèi)外引物、模板DNA、Bst DNA聚合酶、dNTP和緩沖液。其基本操作過(guò)程是將LAMP反應(yīng)體系 (除 Bst DNA聚合酶)在95℃加熱5min后,冷卻,再加入8U Bst DNA聚合酶,在63%保溫60min,然后在高于80℃的溫度下加溫2min終止反應(yīng)。LAMP與以往的核酸擴(kuò)增方法相比，具有操作簡(jiǎn)單,快速高效、高特異性、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。

寄生蟲(chóng)病在人類(lèi)傳染病中有著非常重要的影響。及時(shí)有效的寄生蟲(chóng)病診斷是疾病防治的首要環(huán)節(jié)。寄生蟲(chóng)病檢測(cè)手段有病原學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等。病原學(xué)檢查是常用的確診方法,但易導(dǎo)致漏診或誤診。免疫學(xué)檢測(cè)在敏感性、特異性方面比病原學(xué)法有所提高,但卻存在交叉反應(yīng)、不能區(qū)分現(xiàn)癥患者或既往感染等問(wèn)題。分子生物學(xué)方法在寄生蟲(chóng)病檢測(cè)中敏感性和特異性比前兩者更高,同時(shí)也存在著一些不足,如操作繁瑣、儀器昂貴、擴(kuò)增耗時(shí)等。因此,迫切需要一種敏感性和特異性高、操作簡(jiǎn)便快速的方法用于寄生蟲(chóng)感染檢測(cè)。LAMP是一種嶄新的DNA擴(kuò)增方法,具有簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。目前該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于胚胎性別鑒定及多種病原體的檢測(cè),國(guó)外已有用該法檢測(cè)寄生蟲(chóng)病的相關(guān)報(bào)道。本文就該技術(shù)在寄生蟲(chóng)方面的應(yīng)用綜述如下。

1 華支睪吸蟲(chóng)

華支睪吸蟲(chóng)病在遠(yuǎn)東地區(qū)盛行，是流行地區(qū)的一個(gè)主要健康問(wèn)題。感染者如果不治療，可能會(huì)經(jīng)歷嚴(yán)重的并發(fā)癥，如膽結(jié)石形成，化膿性膽管炎，甚至膽管癌。慢性感染引起一些臨床表現(xiàn)，包括腹部或上腹不適，疲勞，黃疸，嘔吐，發(fā)熱和腹瀉。早期診斷和治療對(duì)預(yù)防嚴(yán)重并發(fā)癥是重要的，因此在診斷資源有限的流行地區(qū)，控制華支睪吸蟲(chóng)需要簡(jiǎn)單可靠的診斷方法。

華支睪吸蟲(chóng)感染是華人、韓國(guó)、越南等東亞國(guó)家主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，若不予以治療，會(huì)引起膽管癌。明確的診斷對(duì)于成功治療和預(yù)防流行地區(qū)的感染是重要的。由于肝吸蟲(chóng)卵和微小腸吸蟲(chóng)之間的形態(tài)相似性，糞便檢查它們有時(shí)會(huì)遺漏輕度感染的病例，并可能導(dǎo)致在物種水平上的錯(cuò)誤識(shí)別。為了克服糞便檢查的診斷限制，ELISAs和PCR已經(jīng)被開(kāi)發(fā)成為一種靈敏而特異的診斷方法，但是它們需要諸如熱循環(huán)儀和分光光度測(cè)定法之類(lèi)的精密設(shè)備，這妨礙了這些技術(shù)在低資源地區(qū)的廣泛使用。LAMP測(cè)定可以在等溫條件（60～65℃）下進(jìn)行;因此，簡(jiǎn)單的水浴或加熱器就足以放大特定的DNA。此外，該檢測(cè)方法可以通過(guò)添加熒光染料目測(cè)檢測(cè)DNA擴(kuò)增。將LAMP分析應(yīng)用于從韓國(guó)的華支睪吸蟲(chóng)病地區(qū)采集的人糞便樣品。使用Kato-Katz方法和實(shí)時(shí)PCR作為參考標(biāo)準(zhǔn)，使用顯示一致結(jié)果的樣品，LAMP測(cè)定顯示出97.1%（95%CI，90.1～99.2） 的靈敏 度和 100%（95%CI，92.9-100）特異性。由于對(duì)糞便樣品中的C.sinensis DNA進(jìn)行了靈敏而特異性的檢測(cè)，LAMP檢測(cè)方法可以在現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用，作為診斷和流行病學(xué)調(diào)查華支睪吸蟲(chóng)的有力工具。

2 日本血吸蟲(chóng)

日本血吸蟲(chóng)寄生動(dòng)物門(mén)靜脈的小血管內(nèi)，引起的對(duì)宿主產(chǎn)生機(jī)械損傷，并引起復(fù)雜的免疫病理學(xué)反應(yīng)。降低血吸蟲(chóng)病流行程度和感染強(qiáng)度尤其重要，準(zhǔn)確的診斷試驗(yàn)在血吸蟲(chóng)病患者管理和控制中起著關(guān)鍵的作用。

診斷是控制血吸蟲(chóng)病的核心。目前可用的診斷方法包括隨訪化療。寄生蟲(chóng)學(xué)技術(shù)（Kato-Katz方法）和抗體檢測(cè)分析（ELISA和IHA）并不理想。Lier等人報(bào)道實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)在豬模型中檢測(cè)低強(qiáng)度日本血吸蟲(chóng)感染。隨后，這種方法被用于臨床試驗(yàn)。這種實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法比顯微鏡方法檢測(cè)到的陽(yáng)性糞便樣本稍多，但在血清和尿樣中一直呈陰性。據(jù)我們所知，大多數(shù)以PCR為基礎(chǔ)的方法都集中在檢測(cè)糞便中特異性的Schistosoma DNA上，所有這些方法都可以看作是對(duì)糞便檢查方法的改進(jìn)，一般來(lái)說(shuō)，血清和尿液樣本比糞便樣本更容易獲得并且在許多人群中被接受，血吸蟲(chóng)DNA將平均分布在患者的整個(gè)血清中，因此，血清樣本中的血吸蟲(chóng)DNA的檢測(cè)在現(xiàn)場(chǎng)條件下會(huì)更準(zhǔn)確。

與PCR不同，LAMP分析不需要通過(guò)熱循環(huán)或通過(guò)電泳檢測(cè)的擴(kuò)增子進(jìn)行擴(kuò)增循環(huán)。以前的研究建立了針對(duì)SjR2的LAMP分析方法，該方法能夠檢測(cè)到0.08 fg日本血吸蟲(chóng)DNA，比普通PCR分析法靈敏度高104倍。LAMP測(cè)定的效用首先在具有非常低的感染強(qiáng)度（EPG=16）的兔子模型中評(píng)估。在評(píng)估循環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）法檢測(cè)光強(qiáng)度感染或假陰性患者的效用，以及評(píng)估患者的化療有效性實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)高度重復(fù)的日本血吸蟲(chóng)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子SjR2目前的研究表明，LAMP分析是敏感的，具體的和可負(fù)擔(dān)得起的，這將有助于通過(guò)有針對(duì)性的治療來(lái)減少血吸蟲(chóng)病的傳播，特別是那些糞檢陰性但可能仍然感染的人。LAMP分析可能為血吸蟲(chóng)病控制和消除策略提供了一個(gè)潛在的工具，特別是對(duì)于與當(dāng)前流行的情況相一致的輕度感染的病例。

3 弓形蟲(chóng)

感染弓形蟲(chóng)寄生蟲(chóng)可以通過(guò)食用含有組織囊腫的生肉，或被卵囊污染的食物和水來(lái)獲得。急性感染可導(dǎo)致孕婦經(jīng)胎盤(pán)傳播給胎兒，嚴(yán)重?fù)p害胎兒，最終導(dǎo)致新生兒畸形，神經(jīng)損傷，失明或死胎。弓形體病的診斷對(duì)控制疾病是重要的。

實(shí)驗(yàn)室診斷歷來(lái)依賴于以下幾種方式之一的急性弓形蟲(chóng)感染。例如，寄生蟲(chóng)學(xué)和組織學(xué)方法是從血液或體液例如組織培養(yǎng)物中分離出速殖子階段。作為PCR的分子生物學(xué)方法是擴(kuò)增特定的弓形蟲(chóng)基因或DNA片段。作為弓形蟲(chóng)感染的診斷方法，也已經(jīng)開(kāi)發(fā)了修改的凝集試驗(yàn)，免疫色譜試驗(yàn)和實(shí)時(shí)PCR法。盡管取得了這些進(jìn)展，但由于血清學(xué)方法費(fèi)時(shí)，并且由于寄生蟲(chóng)抗原制備期間的額外寄生蟲(chóng)物質(zhì)可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，并且有時(shí)不能區(qū)分早期感染，所以弓形蟲(chóng)感染的診斷仍不令人滿意。雖然最近開(kāi)發(fā)了基于PCR的技術(shù)，但是由于反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)和設(shè)備的昂貴成本而受到限制。因此，我們?nèi)匀挥斜匾_(kāi)發(fā)弓形蟲(chóng)的成本效益和快速檢測(cè)方法。LAMP分析也被用于檢測(cè)弓形蟲(chóng)，基于人類(lèi)血液樣本的SAG1，SAG2和B1基因診斷弓形體病。最近，AF146527片段（GenBank登錄號(hào)AF146527）是弓形蟲(chóng)的200～300倍重復(fù)的529bp片段，已被用于開(kāi)發(fā)診斷非常敏感和特異性的PCR，LAMP方法被證明是非常具體和靈敏的檢測(cè)剛地弓形蟲(chóng)在DNA樣本和人體血液樣本。此外，LAMP方法在檢測(cè)弓形蟲(chóng)方面比常規(guī)PCR等其他方法敏感得多。

4 瘧原蟲(chóng)

由于許多分子工具在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性并需要復(fù)雜的設(shè)備，因此它們的使用受到限制。已經(jīng)描述了等溫DNA擴(kuò)增測(cè)定，如環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增。這些測(cè)定法非常適合于現(xiàn)場(chǎng)使用，因?yàn)榉磻?yīng)在單一溫度下進(jìn)行，所以它們不需要熱循環(huán)儀來(lái)進(jìn)行測(cè)試。幾項(xiàng)研究已經(jīng)報(bào)道了使用LAMP分析瘧原蟲(chóng)檢測(cè)。最近，報(bào)道了用LAMP（NINA-LAMP）進(jìn)行瘧疾寄生蟲(chóng)檢測(cè)的非儀器化核酸擴(kuò)增。

已經(jīng)研究了用于LAMP產(chǎn)品讀數(shù)的比色法，取得了一些成功。MG是傳統(tǒng)上用作絲綢，皮革和紙張等材料的染料的有機(jī)化合物，MG染料被稱為基因組指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)（GEAR）測(cè)定的等溫?cái)U(kuò)增測(cè)定。MG-等溫?cái)U(kuò)增分析（LAMP和GEAR）在DNA擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)生綠/藍(lán)色，而負(fù)樣品（無(wú)擴(kuò)增）是無(wú)色的，因此不需要特殊的自動(dòng)閱讀器。顯示使用MG染料的LAMP和GEAR測(cè)定產(chǎn)物的這種視覺(jué)評(píng)估是可重復(fù)的，穩(wěn)健和一致的。MG-LAMP分析的最有吸引力的特征是它可以潛在地用于篩選大量樣品，因?yàn)榭梢允褂帽３趾愣囟鹊募訜釅K進(jìn)行分析。研究中表示使用瘧原蟲(chóng)特異性MG-LAMP分析證明準(zhǔn)確和敏感的瘧疾寄生蟲(chóng)檢測(cè)。

5 隱孢子蟲(chóng)

賈第蟲(chóng)和隱孢子蟲(chóng)是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）是開(kāi)發(fā)的用于DNA擴(kuò)增的技術(shù)，其對(duì)DNA污染物的效率和不敏感性優(yōu)于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。在奧爾杜省，黑海中部，土耳其共采集了70個(gè)水樣，包括水龍頭，河流，噴泉和井水，并調(diào)查了隱孢子蟲(chóng)卵囊的檢測(cè)。通過(guò)顯微鏡直接篩選隱孢子蟲(chóng)卵囊的免疫熒光檢測(cè)，然后通過(guò)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）和巢式聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）提取DNA進(jìn)行分子檢測(cè)。70個(gè)水樣中有18個(gè)（25.7%）水樣被發(fā)現(xiàn)為隱孢子蟲(chóng)屬。通過(guò)免疫熒光試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)19例（27.1%）LAMP陽(yáng)性。在任何被調(diào)查的水樣中都沒(méi)有產(chǎn)生巢式PCR產(chǎn)物?？偣搽S機(jī)選擇16個(gè)水樣，加入10個(gè)隱孢子蟲(chóng)卵囊以測(cè)試所用方法的效率。所有的樣品都被LAMP發(fā)現(xiàn)為隱孢子蟲(chóng)DNA的陽(yáng)性，而在16個(gè)檢測(cè)的加標(biāo)樣品中只有7個(gè)（43.75%）的巢式PCR檢測(cè)為陽(yáng)性。

6 細(xì)粒棘球蚴

由細(xì)粒棘球蚴引起的囊狀棘球蚴病是導(dǎo)致廣泛胃腸疾病的原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)。這些致病原生動(dòng)物暴發(fā)中有90%是通過(guò)水發(fā)生的。從公共衛(wèi)生角度來(lái)說(shuō)具有重要的重要性，并且也具有顯著的社會(huì)經(jīng)濟(jì)影響。

對(duì)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室診斷和監(jiān)測(cè)，DNA方法有一個(gè)實(shí)質(zhì)性的缺點(diǎn)，即常規(guī)PCR的敏感性可能受到糞便樣品中存在的抑制因子的嚴(yán)重影響。一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）的有效的監(jiān)測(cè)工具，用于檢測(cè)在現(xiàn)場(chǎng)收集的陽(yáng)性犬糞便樣品。采用LAMP，PCR和copro-ELISA分析，現(xiàn)場(chǎng)采集的糞便標(biāo)本陽(yáng)性率分別為12.6%，1.6%和2.1%。從對(duì)照組獲得的所有樣品都是陰性的。與常規(guī)PCR相比，LAMP測(cè)定法提供了88.8%的特異性和100%的靈敏度。

7 結(jié)語(yǔ)

LAMP方法在臨床樣品處理中顯示出更高的靈敏度和有效率。盡管不同的LAMP檢測(cè)方法的檢測(cè)率不同，但LAMP方法在特異性，快速性，靈敏度方面仍然具有優(yōu)勢(shì)，并且易于在獸醫(yī)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。需要做更多的工作來(lái)進(jìn)一步改進(jìn)LAMP方法寄生蟲(chóng)病的診斷方法，甚至其他病原體。其臨床快速，可靠的診斷在發(fā)展中國(guó)家尤其是基層有重要意義，如能廣泛運(yùn)用將對(duì)我國(guó)寄生蟲(chóng)防控帶來(lái)巨大效益。