·綜 述·

錢 杰1，馮興梅2**

（1南通大學醫(yī)學院口腔系，江蘇226001；2南通大學附屬醫(yī)院口腔科）

干細胞（stem cell）是一類未分化的具有多向分化潛能和自我復制能力的原始未分化細胞，根據(jù)其來源可分為胚胎干細胞和成體干細胞。近年來干細胞在再生醫(yī)學領(lǐng)域中扮演越來越重要的角色，干細胞通過增殖、分化，可以修復、再生受損或缺失的組織器官。2000年Gronthos通過酶消化法從人的第三磨牙牙髓中分離、培養(yǎng)得到具有克隆能力并快速增殖的牙髓干細胞，將其命名為牙髓干細胞（dental pulp stem cell，DPSC）[1]。牙髓間充質(zhì)干細胞（DPMSCS）以其自我更新、可塑性和多潛能的高增殖潛力而著稱[2]。牙髓干細胞可以多向分化為成牙本質(zhì)細胞、成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等，且易于獲得。因此，牙髓干細胞應(yīng)用廣泛，在一些方面比骨髓干細胞、胚胎干細胞等更具優(yōu)勢。本文就牙髓干細胞的研究新進展做一綜述。

1 牙髓干細胞的生物學性狀

牙髓干細胞是從正常的人類牙髓中分離的有功能的干細胞，大多數(shù)細胞呈長梭形，體積較小。DPSC是神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)干細胞[3]，具有多向分化、自我更新的能力，且能夠長期低溫保存。牙髓干細胞增殖能力非常強，其體外增殖率高于骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow stem cell，BMSC）[1]。免疫組織化學方法發(fā)現(xiàn)牙髓干細胞表達多能標記物Oct-4、Lin-28、Sox-2和Nanog，可依據(jù)中胚層標記物Stro-1和CD146來鑒定[4]，在體外一定條件下可以形成礦化結(jié)節(jié)，在不同的培養(yǎng)環(huán)境下可以分化為多種細胞。

2 牙髓干細胞的應(yīng)用

2.1 在牙髓、牙本質(zhì)再生中的應(yīng)用 齲齒和牙髓炎引起的牙髓脫落，可導致牙齒脫落和生活質(zhì)量下降，目前利用牙髓干細胞進行生物再生治療取得不錯的進展。Iohara等[5]在成人牙齒行牙髓切斷術(shù)后，將牙髓干細胞及基質(zhì)細胞來源的因子1移植到根管中，14天后根管內(nèi)形成神經(jīng)、血管在內(nèi)的牙髓組織，表明干細胞治療可以保存和保護牙齒。Gronthos等[1]將DPSC結(jié)合HA/TCP（羥基磷灰石/磷酸三鈣）粉末后植入裸鼠皮下，術(shù)后6周在HA/TCP微粒表面形成牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，形成的牙本質(zhì)細胞表達牙本質(zhì)涎蛋白、牙本質(zhì)磷蛋白等。Nakashima等[6]通過電穿孔介導的基因傳遞技術(shù)，將生長/分化因子11（GDF11）導入DPSC中，誘導DPSC分化為成牙本質(zhì)細胞，表達成牙本質(zhì)細胞標記物牙本質(zhì)涎蛋白（Dsp），體內(nèi)實驗中可形成修復性牙本質(zhì)。

2.2 修復牙槽骨缺損 最近的臨床試驗表明，DPSC能夠明顯促進牙槽骨缺損的修復，可以給頜面骨缺損修復或是種植骨量不足的患者提供一種生物再生治療的選擇[2]。骨組織再生工程由三部分組成，包括種子細胞，三維支架以及成骨分化因子。在αMEM培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清，1%P/S，10 nmol/L地塞米松，10 mmol/L甘油磷酸酯和100 μmol/L抗壞血酸磷酸鹽，即成骨誘導培養(yǎng)基（OM），DPSC在OM中成骨分化[7]。DPSC表達成骨標記物包括骨涎蛋白（BSP）、堿性磷酸酶（ALP）、牙本質(zhì)涎蛋白（DSP）以及骨鈣素（OCN）等[8]。Fujii等[7]利用細胞薄片技術(shù)（cell-sheet technology），將DPSC薄片移植入顱蓋骨缺陷的小鼠模型中，觀察到骨再生。細胞薄片技術(shù)無需使用支架，為DPSC移植再生提供安全性和方便性。

2.3 修復神經(jīng)組織 DPSC具有親神經(jīng)性質(zhì)，能夠治療很多神經(jīng)疾患[2]。DPSC由于其自身的神經(jīng)特性，可用于周圍神經(jīng)再生[2]。Ullah等[9]將分離的DPSC以及DPSC分化的神經(jīng)細胞分別置于纖維蛋白支架和膠原蛋白神經(jīng)套管，后植入坐骨神經(jīng)切斷的大鼠模型中，12周后發(fā)現(xiàn)處理組均有明顯的行為活動和肌肉收縮力。免疫組織化學分析顯示，處理組有血管生成、表達軸突纖維和髓鞘的特異性標記。DPSC是神經(jīng)再生的一個極好的干細胞來源，可以表現(xiàn)出足夠的外周神經(jīng)再生潛力。Nicola等[10]在脊髓損傷Wistar鼠模型中，DPSC移植后配合跑步機訓練，可降低TNF-α水平，保護神經(jīng)。Zhang等[11]實驗表明，與殼聚糖結(jié)合，DPSC產(chǎn)生的神經(jīng)分化能夠治療脊髓損傷和其他退行性疾病。Nicola等[12]體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，DPSC可降低脊髓損傷中早期神經(jīng)元細胞凋亡，有助于組織和運動神經(jīng)元的保存。Apel等[13]研究表明，DPSC在阿爾茨海默氏病和帕金森病體外模型中能夠保護主要神經(jīng)元，起營養(yǎng)神經(jīng)的作用。有研究證明，DPSC具有更強的神經(jīng)保護作用和促進視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞神經(jīng)突生成作用[14]。

2.4 修復循環(huán)系統(tǒng) 已有許多研究報道，MSC移植可改善心肌梗死。Gandia等[15]將DPSC注入心肌梗死裸大鼠模型內(nèi)，發(fā)現(xiàn)血管生成增加，心肌梗死面積減少，左心室功能改善。Nagpal等[16]臨床試驗證明，體外擴增后的DPSC顱內(nèi)注射入腦梗部位，能改善中風后遺癥。研究顯示，DPSC移植到腦卒中病灶后，2.3%的移植細胞存活，可以分化為星形膠質(zhì)細胞。在腦缺血動物模型中，回植DPSC4周后，前肢感覺運動功能得到顯著改善。DPSC干細胞療法可改善卒中患者的預后[17]。

2.5 組織工程牙 Yu等[18]研究顯示，在大鼠模型中DPSC與根尖蕾細胞組成的微球形成典型的牙齒樣組織，其牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)構(gòu)成均衡。Lee等[19]采用3D打印技術(shù)形成微支架，利用DPSC產(chǎn)生牙本質(zhì)、牙骨質(zhì)、牙周膜和牙槽骨復合物。施松濤教授提出的“再生生物牙根”概念，首次在小型豬頜骨內(nèi)獲得成功[20]。

2.6 肌肉組織再生 一些肌萎縮、肌營養(yǎng)不良患者需要種子細胞進行再生修復。Yang等[21]證實DPSC可產(chǎn)生肌源分化，改善肌營養(yǎng)不良癥狀，表明DPSC治療肌肉再生的潛力。2017年有報道，DPSC通過血流重建、旁分泌信號作用；直接供應(yīng)的方式，對營養(yǎng)不良的骨骼肌有積極影響[22]。Song等[23]將DPSC暴露于添加有TGF-β1的適宜膀胱平滑肌細胞生長的微環(huán)境中，14天后平滑肌細胞特異性標志物α-SMA、結(jié)蛋白、鈣調(diào)蛋白表達升高。Pisciotta等[24]研究發(fā)現(xiàn)，DPSC移植到mdx/SCID小鼠肌肉中，可通過旁分泌效應(yīng)促進血管生成并減少纖維化，改善營養(yǎng)不良肌肉的組織病理學，并可能減輕假肥大性肌營養(yǎng)不良患者的肌肉無力。DPSC在一定條件下能夠分化為肌腱系細胞，在DPSCs-PGA復合支架材料上，在力學刺激的條件下，在裸鼠背部可形成肌腱樣組織[25]。

2.7 炎癥牙髓組織再生 由于牙髓干細胞來源局限，而成人不可逆性牙髓炎的發(fā)生非常普遍，不可逆性牙髓炎中是否存在一類具有干細胞特性的牙髓細胞？是否能應(yīng)用于組織再生[26]？2010年Alongi等[27]從牙髓炎（inflamed pulps，IPs）中分離出牙髓干細胞（DPSCs-IPs），免疫組織化學分析顯示DPSCs-IPs表達 STRO-1、CD90、CD105和 CD146等間充質(zhì)干細胞標記。將DPSCs-IPs植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)，可形成牙髓牙本質(zhì)復合體。2012年P(guān)ereira等[28]比較從正常牙髓和炎癥性牙髓中分離的牙髓干細胞特性，發(fā)現(xiàn)兩者形態(tài)、增殖率和分化潛力相似，表明炎癥過程并不影響干細胞特性。2017年Nakashima等[29]對5例不可逆性牙髓炎患者分離、培養(yǎng)牙髓干細胞，再將其植入牙齒中，其中3例形成有功能的牙本質(zhì)。因此，DPSCs-IPs憑借在體內(nèi)的組織再生潛能，可作為再生醫(yī)學的“種子細胞”。

2.8 DPSC的免疫調(diào)節(jié)作用 Pierdomenico等[30]研究表明，在異體骨髓移植中DPSC抑制植物血凝素刺激的T細胞增殖，其抑制效果優(yōu)于骨髓干細胞與T細胞混合培養(yǎng)。Yamaza等[31]研究發(fā)現(xiàn)，DPSC的免疫調(diào)節(jié)特性可用于治療SLE，DPSC移植抑制Th17活性，上調(diào)并恢復外周血中Tregs/Th17比率，逆轉(zhuǎn)MRL/lpr狼瘡鼠的系統(tǒng)性紅斑狼瘡表型，并可重建SLE患者和狼瘡鼠的成骨壁龕。

3 DPSC外泌體

外泌體是細胞分泌的微小囊泡，是各種直徑30～100nm的膜性構(gòu)件的總稱[32]，能被大部分細胞釋放、攝取，促進細胞間的交流[33]。外泌體包含RNA物質(zhì)（信使RNA和微RNA）、胞漿蛋白和反膜蛋白[34]。DPSC能遷移至受損的組織區(qū)域，分泌多種功能因子并支持受損組織再生，其中DPSC釋放的外泌體參與細胞間旁分泌的相互作用，通過誘發(fā)內(nèi)源性修復過程來發(fā)揮治療作用[2]。在前體藥物5-FC存在的條件下，經(jīng)酵母尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因修飾的DPSC釋放的外泌體能夠入侵并殺死腫瘤細胞[35]。因此，從這些基因重新編碼的細胞中分泌的外泌體有可能成為新一代的醫(yī)學生物產(chǎn)品[2]。Huang等[3]在1 cm×1 cm臨床級Ⅰ型膠原膜（Zimmer CollaCote）上添加DPSC來源的外泌體，然后播種DPSC，將膜放入厚度3～4 mm的人牙根切片根管內(nèi)，植入裸鼠背部皮下2周，免疫熒光和HE染色發(fā)現(xiàn)牙根切片的根管空間內(nèi)有牙髓樣組織再生。人骨髓間充質(zhì)干細胞（HMSC）內(nèi)吞DPSC來源的外泌體后，牙本質(zhì)涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）基因表達增加，可更有效介導HMSC的牙源性分化。Pivoraite˙等[36]研究首次證明，從人牙髓干細胞中提取的外泌體可抑制卡拉膠誘導的小鼠急性炎癥反應(yīng)。牙髓干細胞外泌體的應(yīng)用，不需要直接使用細胞，從而避免細胞移植相關(guān)的限制和風險。

4 問題和展望

牙髓干細胞憑借其安全性、易獲取、體外培養(yǎng)增殖能力強、免受倫理爭議等優(yōu)勢，成為干細胞治療的明星細胞之一。DPSC主要來源于阻生的智齒和正畸拔出的牙，從脫落的乳牙，甚至炎癥牙髓組織也可獲取具有一定再生功能的牙髓干細胞。DPSC來源豐富，長期低溫保存而不喪失多向分化的能力，為牙髓干細胞儲存銀行的開建奠定理論基礎(chǔ)。然而，在DPSC的臨床應(yīng)用中仍有許多問題。牙髓干細胞在體外培養(yǎng)擴增較難，對于如何選擇性能最好的DPSC進行移植，細胞附著的支架以及細胞移植受體區(qū)域的微環(huán)境等問題不甚明了，需要進一步探索和研究。

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