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(婁底職業(yè)技術學院，湖南 婁底 417000)

0 引言

“雞新城疫抗體水平測定”競賽做為農(nóng)林牧漁專業(yè)大類中全國職業(yè)技能大賽的重要賽項已經(jīng)開展多年。通過競賽，一方面深化了職業(yè)教育教學改革，推進了校企深度合作、產(chǎn)教高度融合，培養(yǎng)了一大批高、精、尖技能型人才，為產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了技術支撐，另一方面能夠不斷發(fā)現(xiàn)操作中存在的不足，進一步完善操作規(guī)程，全面提高檢測效能，創(chuàng)造更好的經(jīng)濟效益和社會價值，確保行業(yè)生產(chǎn)更加安全。本文筆者結合近年來指導學生參加雞新城疫抗體水平測定賽項競賽指導體會、賽項規(guī)定[1]和多年的臨床檢測經(jīng)驗，總結出來的一些操作關鍵技術要點，供同仁們參考。

1 室溫控制是保障

實驗室溫度的高低直接影響試驗結果。為保障試驗順利進行，技術人員或賽點單位在試驗要高度重視、精心安排做好這項工作。

1.1 低溫影響

低溫環(huán)境下，在試驗開始前要打開空調(diào)預溫，待室溫達到20℃時才能開展試驗。試驗表明：室內(nèi)溫度低于20℃就開展試驗，或室內(nèi)溫度不能穩(wěn)定在20℃～25℃，紅細胞沉淀的時間延長，HI試驗滴度與標準滴度相差1～2個，有的甚至不能判定結果。

1.2 高溫影響

當室溫超過25℃，濕度低于50%時，水份蒸發(fā)，反應物解離，紅細胞自溶，后續(xù)試驗就無從談起。

2 移液精準是核心

2.1 校準設備

試驗前，要細心檢查移液設備，校準移液器，確保移液量精準。如果比賽，賽點單位要對所有移液設備認真校驗，減少誤差，保證選手公平參賽。

2.2 調(diào)節(jié)量程

吸液前要將量程調(diào)到目標刻度，操作中也要注意觀察量程是否自動移位，防止移液量發(fā)生變化，影響試驗結果。

2.3 裝配吸頭

將移液槍垂直對準吸頭，稍微用力下壓并向左向右轉動180°角即可上緊，杜絕用力反復錘撞吸頭。移液前先校驗吸頭是否裝緊、吸嘴是否有堵塞和歪斜等現(xiàn)象。若吸頭未裝緊輕則吸頭內(nèi)出現(xiàn)氣泡，吸液量不足，重則吸頭掉落；吸孔有堵塞則吸不上液；若吸頭嘴歪，放液時液體會斜向打出，等等，發(fā)現(xiàn)問題都要更換吸頭。

2.4 正確移液

正向移液，用大拇指按到第一檔，并將吸頭尖端垂直浸入液面3 mm左右[2]，釋放按鈕，液體進入吸頭；放液時，將移液器垂直對準反應板孔，快速按到二檔，將液體打入孔內(nèi)。操作時避免打液后吸頭內(nèi)外存留液體；切忌放液時將液體打在反應板孔壁周圍及孔外；加液時杜絕吸嘴碰觸反應板孔的液面；倍比稀釋時移液器要往順手方向傾斜5°～10°角，既要防止吸嘴垂直頂住孔底壁吹打不動，又要防止吸嘴浮出液面吸入空氣吹出氣泡，每孔吹打速度要均勻、不能過快，吹打次數(shù)要一致；加紅細胞懸液時最好從后往前懸滴加入[3]，每加一排要搖勻杯內(nèi)液體；記住每滴加一個樣要及時更換吸頭[4],否則均會出現(xiàn)試驗誤差。

3 懸液配制是前提

3.1 采血

采血過程兩人配合要默契[5]。采血前要準備好酒精棉球、干棉球、吸入含抗凝劑的采血器(抗凝劑與血液的比例為1∶4)。抓雞要輕、穩(wěn)、準、巧。雞抓出后，在雞籠上側臥保定。助手一手抓住雞的小腿與后腳骨并固定好跗關節(jié)，防止雞腿劃動，另一手抓住雞翅，呈扇形張開固定，雞胸部朝向采血者。采血部位消毒，用拇指壓住近心端，血管怒張后，針頭先挑起血管側邊皮膚，再由翼根向翅方向平行刺入靜脈，見回血，放松對近心端的按壓，緩慢抽取血液。采血完畢一手用干棉球按壓止血，另一手蓋上采血器針帽，將采血器稍向后抽，輕輕搖勻血液，防止血液凝固。

3.2 配平

擰掉采血器上的針頭，將采血器中混勻后的血液(2.5 mL)沿離心管壁輕輕注入已加有少量生理鹽水并標記“雞血”的離心管中，防止紅細胞破壞，再緩慢加入生理鹽水至10 mL吹打混勻，與標記“鹽水”的離心管用天平配平。配平時應先使天平上的燒杯平衡，再將離心套管和離心管放入燒杯中配平。如果不平衡，一般用移液器向標注的“鹽水”離心管內(nèi)添加或吸出生理鹽水，直至配平。配平后蓋上離心管蓋準備離心。

3.3 離心

接通電源，將已配平的“雞血”和“鹽水”兩個離心管及套管放入離心機中，蓋上離心機蓋，調(diào)好時間和轉速，前兩次分別離心5 min,第三次離心8 min，轉速2 000 r/min。注意每次離心前都要配平，離心管中的液量不要超過最大量程刻度。離心時必須看守，如有異常，應馬上停用。使用完畢，各項數(shù)據(jù)歸零，關掉電源。

3.4 洗滌

先要吸取白細胞和血小板層，此時要注意動作輕、速度慢、吸量微，避免吸走紅細胞，然后吸取剩余的透明液體。在沉淀的紅細胞中再加入稀釋液(生理鹽水)，吹打混勻、洗滌、離心，以此類推，一般洗滌3次即可。

3.5 懸液配制

最后一次離心完畢，按所需1%紅細胞的量，用移液器垂直從離心管中、下部吸取壓積紅細胞放入已加好需量生理鹽水的燒杯中，搖勻備用。

3.6 問題處理

雞只采血部位要嚴格消毒，避免污物進入血液。如采血不暢，采血器內(nèi)會產(chǎn)生血凝塊，所采血液失去試驗價值，必須棄之重來。若使用檸檬酸鈉抗凝劑，其配制濃度必須精準，如果濃度過低，離心后會產(chǎn)生膠凍樣物質。個別雞只的紅細胞有自凝現(xiàn)象，因此應準備3只以上的雞[6]。離心結束，紅細胞沉于離心管底，上液清亮透明，可認定紅細胞配制成功；若上液顯紅色，說明懸液制作失敗。制作懸液時因表面部分紅細胞濃度相對較低，配制的懸液濃度不夠，所以應抽取管內(nèi)中、下處的紅細胞。

4 4HAU病毒濃度是基礎

根據(jù)血凝試驗結果配制4HAU病毒。首先根據(jù)需要準確計算出生理鹽水和抗原的量，然后用適量移液器在小燒杯中加入生理鹽水，再加入抗原，并反復吹洗混勻。因4HAU病毒濃度直接影響試驗結果，最好做一個回滴實驗[7]，校正4HAU病毒的配制濃度。

5 適宜感作是重點

感作需要時間。在這個過程中，有的性急，為了使紅細胞盡快沉下孔底，或使4HAU抗原盡快混勻，在板上使勁地敲，這是不合規(guī)的，容易震碎紅細胞，震出液體等；有的不根據(jù)實際反應結果而機械地按照規(guī)定的時間去等，這樣浪費時間。因此，在感作過程中應做好以下工作：加4HAU抗原后，為了混勻，可以輕叩反應板或使用微型震蕩器震蕩30～60 s，使其充分混均勻。感作時間規(guī)定不少于30 min，不能任意縮短時間。1%雞紅細胞懸液加完后，可以輕晃或用微型震蕩器震蕩20-30 s，使其混合均勻，感作時間是一個變數(shù)，要與對照孔的實際結果有機結合。

6 結果判定是關鍵

結果判定，首先牢記一個“明顯”，即兩個試驗均以生理鹽水對照孔紅細胞呈現(xiàn)“明顯”鈕扣狀沉到孔底時才能判定結果，否則需要繼續(xù)等待。然后把控兩個“完全”，兩個“完全”的區(qū)別在于血凝試驗時，傾斜反應板后紅細胞“完全”不流動，說明紅細胞被病毒凝集，以完全凝集的病毒最大稀釋度確定為該抗原的血凝滴度；血凝抑制試驗，將反應板傾斜，從背側觀察，紅細胞呈淚珠狀“完全”流下，產(chǎn)生完全不凝集的最高稀釋度就是滴度。

[1] 2017年全國職業(yè)院校技能大賽福建賽區(qū)組委會.2017年全國職業(yè)院校技能大賽賽項指南[Z].2017.

[2] 王麗娟,卜春華.參加全國雞新城疫抗體水平測定競賽的體會[J].養(yǎng)殖與飼料,2015(6):27-28.

[3] 陳文東,蘇滿春,朱秀娟,等.指導高職生參加雞新城疫抗體水平測定技能大賽的體會[J].甘肅科技,2017,33(3):33-34+49.

[4] 王麗娟.雞新城疫抗體水平測定技能大賽體會總結[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2015(16):200-202.

[5] 楊永倩,張勃偉,成夢玲.雞新城疫抗體水平測定技能大賽培訓總結[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2016,44(20):240-241.

[6] 姜洶.影響雞新城疫抗體水平測定結果的因素[J].當代畜牧,2017(15):47.

[7] 陸品紅,王麗娟.4HUA抗原回滴操作在禽流感試驗中的重要性[J].中國畜禽種業(yè), 2009, 5(8): 134.