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(1.山東省蓬萊市大辛店畜牧獸醫(yī)工作站， 山東 煙臺 265612；

0 引言

鴨傳染性漿膜炎又叫鴨疫里默氏桿菌病，是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的鴨的一種接觸性、急性或慢性、敗血性的傳染病，主要侵害2～7周齡的小鴨[1]。該病的特征為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪性輸卵管炎、關(guān)節(jié)炎及麻痹，是造成小鴨死亡最嚴重的細菌性傳染病之一，廣泛分布于世界上各養(yǎng)鴨國家[2]。疫苗免疫接種是控制該疾病非常有效的措施，但RA血清型較多(到目前為止，共報道有21個血清型)，各血清型之間沒有交叉保護，這要求使用疫苗的抗原血清型必須和生產(chǎn)中流行菌株的血清型相一致[3]。因此，對RA在鴨群中的流行情況進行分離鑒定將有助于該疫苗的研制生產(chǎn)，以達到控制疾病的要求。

1 實驗目的

通過分離細菌，鑒定分離細菌的血清類型，從而了解我國目前鴨養(yǎng)殖區(qū)鴨傳染性漿膜炎的主要流行血清型類型，以用于指導疫苗的研制。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

2.1.1 標準血清及培養(yǎng)基

抗1-21型RA 標準血清由成都天邦生物制品有限公司提供。普通營養(yǎng)瓊脂、半固體瓊脂、麥康凱瓊脂、巧克力瓊脂、5% 綿羊鮮血瓊脂、P-L肉湯及P-L瓊脂由實驗室制備。

2.1.2 臨床樣品

來自全國主要鴨養(yǎng)殖區(qū)的患有典型鴨傳染性漿膜炎的臨床樣品用于鴨里默氏桿菌的細菌分離鑒定。

2.1.3 實驗動物

實驗昆明種小白鼠，體重20 g，購置華西醫(yī)科大學實驗動物中心；健康雛鴨，購置某種鴨場生產(chǎn)的4日齡雛鴨，購買后隔離飼養(yǎng)3 d，經(jīng)鑒定健康后于7日齡用于細菌致病性實驗和免疫實驗；鴨胚由非免疫鴨蛋孵化而來。

2.2 實驗方法

2.2.1 細菌分離

無菌取病死鴨的腦、心血、肝臟、脾等病料，接種于麥康凱瓊脂、巧克力瓊脂等，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，再挑取單個菌落作進一步純培養(yǎng)。無菌取相同病料常規(guī)處理后接種于10 日齡鴨胚絨毛尿囊腔(0.2 mL/胚)。觀察鴨胚能否產(chǎn)生病變或死亡，若鴨胚不死亡，則盲傳3代。

2.2.2 標準及待檢菌株抗原的制備

將RA 接種至P—L瓊脂平板，培養(yǎng)24 h后，用FPSS(含0.3%甲醛的生理鹽水)洗下菌落并離心，用FPSS洗滌，離心2次，最后將菌體以FPPS懸浮，調(diào)節(jié)至D525nm值為0.2作為制備抗血清的抗原和用作試管凝集的抗原[4]。細菌經(jīng)P-L瓊脂平板培養(yǎng)24 h，每平板純培養(yǎng)物用l0 mL溶液(0.3%甲醛、8.5%NaCL、0.02 moL/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0)洗下制成菌懸液，于沸水中煮1 h，冷卻后，4 000 r/min離心30 min，上清液作為瓊擴抗原。

2.2.3 抗標準及其抗待檢菌株抗體的制備

將2.2.2制備的抗原與等量的弗氏完全佐劑研磨成乳劑，于第l、8、15、23 d免疫體重為3 kg的健康雞，每只雞皮下注射0.5mL(分5點注射，每個注射點0.1 mL)，第30天每只雞靜脈注射0.5 mL不含佐劑的菌體抗原，第45天采血檢測抗體效價，瓊擴效價≥1：32為合格。

2.2.4 分離菌的鑒定

2.2.4.1 形態(tài)特征

將各株細菌24 h肉湯靜置純培養(yǎng)菌涂片，革蘭氏染色，油鏡觀察；將液體培養(yǎng)菌離心，收集菌體，再用生理鹽水洗3次后，用適量生理鹽水懸浮，先在銅網(wǎng)上吸附5 min，再用2 磷鎢酸(pH 6.8)負染3 min，吸干水分，用H-6O透射電鏡觀察。

2.2.4.2 PCR 檢測

應(yīng)用PCR方法快速檢測鴨里默氏桿菌，檢測引物如下。

P1: 5 ’ - GAACTTTGGTCTTGGTATCC - 3 ’

P2: 5 ’ - CAGATGCAGCTCTTTCTCTA - 3 ’

擴增片段長度為671bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoR I酶切進行進一步鑒定，酶切反應(yīng)在20 μL體系中進行，包括：10ul PCR 純化產(chǎn)物，2 μL EcoR I,2 μL EcoR I buffer ，加水至20 μL，37 ℃作用6 h。PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2.2.5 血清學鑒定

玻片凝集試驗：于凈載玻片滴蒸餾水1滴，用接種環(huán)沾取待檢菌的純培養(yǎng)物少許，于蒸餾水中混勻，滴加未稀釋的陽性血清1滴。將載玻片輕輕反復擺動，或用接種環(huán)涂開，同時觀察結(jié)果，幾秒鐘后，出現(xiàn)清晰的乳白色絮狀凝集塊者，即為陽性反應(yīng)。

瓊脂擴散沉淀試驗：NaCL和瓊脂糖的最終濃度分別為8.5%和0.9%，打梅花孔，血清加在中央孔，抗原加在外圍6個孔。置37℃濕盒中過夜后，判讀結(jié)果。

2.2.6 不同血清型菌株的致病性試驗

雛鴨接種試驗：用滅菌生理鹽水洗下24 h固體培養(yǎng)基上的菌落，調(diào)整菌數(shù)為3.0×109CFU/mL。頸部皮下注射，0.4 mL/只。每個血清型選擇1株細菌接種7日齡鴨10只，隔離飼養(yǎng)。同時設(shè)相應(yīng)株細菌相同菌數(shù)煮沸5 min接種7日齡鴨10只作對照。出現(xiàn)病死鴨，作細菌分離試驗，以確定其死因。

小鼠接種試驗：3只昆明小鼠腹腔接種步驟(1)相應(yīng)株細菌各0.5mL，3只小鼠不接種作為對照，均隔離飼養(yǎng)。

3 結(jié)果

3.1 形態(tài)特征

不同血清型鴨疫里默氏桿菌的形態(tài)特征相同，均為革蘭氏陰性的小桿菌，無芽胞，不能運動，有莢膜。純培養(yǎng)菌涂片，美藍染色，可見菌體多為桿狀，常單個存在，少數(shù)成雙排列，偶見個別菌體呈長絲狀排列；經(jīng)瑞氏染色的標本，可見部分菌體兩端濃染。透射電鏡觀察顯示，菌體無菌毛或鞭毛。

3.2 PCR鑒定

各個檢測菌株經(jīng)PCR擴增后，經(jīng)1%的瓊脂糖電泳出現(xiàn)了預期的目的條帶(671bp)，對PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoR I 酶進行酶切，經(jīng)1%的瓊脂糖電泳出現(xiàn)了預期的的494bp和177bp兩條酶切條帶，說明待檢菌株均含有鴨里默氏桿菌菌株。

3.3 分離菌的致病性

各血清型受試菌株普遍具有較強的致病性，雛鴨接種后48 h，部分鴨開始出現(xiàn)癥狀。剖檢可觀察到心包炎、肝周炎和氣囊炎、脾腫大等典型病變。

3.4 血清型分布

從不同地方分離到的鴨里默氏桿菌的血清型分布見表1。從表1可以看出，我國目前鴨里默氏桿菌的血清型有1～8型、10、11型、13型、14型，15型，其中1型所占比例最大，是我國最主要的血清流行型。

表1 我國鴨里默氏桿菌不同血清型分布

4 結(jié)語

本實驗項目從全國各地送檢的樣品中一共分離到1 151株鴨里默氏桿菌，從血清型實驗結(jié)果可以知道，目前我國鴨的主要養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)鴨里默氏桿菌的血清型為1型，占本次分離菌株的36.5%(420株/1151株)，為該病原的優(yōu)勢流行血清型。

[1] 馮秀紅, 馮開容, 曹建偉,等. 1例鴨疫里默氏桿菌病的診治[J]. 養(yǎng)禽與禽病防治, 2013(2):19-20.

[2] 孫樂天. 鴨傳染性漿膜炎的癥狀、診斷及防制措施[J]. 飼料博覽, 2017(5):57.

[3] 周小進. 鴨疫里默氏桿菌特異性單克隆抗體的研制以及生物被膜和OmpA缺失株的研究[D].江蘇:揚州大學, 2010.

[4] 何輝. 華南地區(qū)鴨疫里默氏桿菌流行病學調(diào)查及四價滅活疫苗的研制[D].廣東:華南農(nóng)業(yè)大學, 2006.

向華莉，女，高級畜牧師，從事種鴨飼養(yǎng)繁育工作。