夏嘉躍，殷德輝徐州醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，江蘇徐州 221004

布魯氏菌?。╞rucellosis）是革蘭氏陰性菌——布魯氏菌所引起的人獸共患傳染病，簡稱布病，是我國法定的乙類傳染病。目前，布病在全球范圍內仍然有較高的發(fā)病率及流行趨勢，對人畜的健康安全構成危害。在歐洲等許多發(fā)達國家和地區(qū)，雖然公告消滅了布病，但是近年來隨著經濟全球化的發(fā)展，布病作為一種旅游輸入傳染病，其呈現(xiàn)出死灰復燃的趨勢，而在一些發(fā)展中國家或地區(qū)如非洲、中東、拉美以及亞洲的部分地區(qū)，布病仍然沒有被較好地控制，發(fā)病和流行較為嚴重[1]。目前布魯氏菌病的診斷較為困難，如不能及時診斷治療，可導致感染進一步損傷人體系統(tǒng)，引起嚴重并發(fā)癥，甚至死亡。由于布病對畜牧養(yǎng)殖業(yè)以及人體健康安全構成了嚴重威脅，因此積極開展預防布病工作具有重要意義，當前疫苗接種是防控布病的主要手段。目前研發(fā)的布魯氏菌的疫苗種類很多，減毒活疫苗已經被廣泛應用牛羊豬等家畜，但減毒活疫苗毒性一般比較高，可造成懷孕家畜的流產，此外，利用普通的血清學檢測無法區(qū)分自然感染和接種疫苗的牲畜，增加了診斷的難度[2]。對于突變菌株而言，雖然對宿主具有一定的保護作用，但是從安全和性質方面考慮，仍然存在著不確定性，可能存在回復突變而致病性增強，應用受到很大限制。因此，無安全隱患且具有較好保護作用的亞單位疫苗成為了布病研究的新熱門。當下關于布魯氏菌亞單位疫苗的研究主要概括為如下幾個方面。

1 DNA亞單位疫苗

DNA疫苗是將能夠表達特定目的基因的DNA質粒注射入宿主中，其在宿主體內開始轉錄和翻譯，最終表達出抗原物質，產生特定的免疫反應，從而構造出具有選擇性的疫苗。DNA疫苗具有很多優(yōu)點，比如較高的安全性和功效性、室溫穩(wěn)定性等[3]。

通過歸納總結先前研究的成果，目前DNA疫苗主要有基于 Omp31、Omp25、L7/L12、p39、核糖體蛋白L9及GroEL等為靶標的基因[4-6]。有研究利用布魯氏菌核糖體蛋白L7/L12和外膜蛋白omp31設計出了pcDNA-L7/L12-Omp31的二價DNA疫苗，實驗研究發(fā)現(xiàn)，該疫苗引起T細胞的大量增加，并且使機體產生干擾素，其免疫保護程度明顯高于單價疫苗[7]。

目前許多研究已經表明DNA疫苗可以引誘機體產生較強的細胞毒性反應和Th1反應，對多種微生物具有一定的保護作用。并且，對于DNA疫苗來說，由于其沒有致病性增強的現(xiàn)象，所以其安全性有所保障。然而，到目前為止尚未發(fā)現(xiàn)單價DNA疫苗效力優(yōu)于傳統(tǒng)疫苗。對于DNA疫苗而言，其產生的細胞免疫反應相對蛋白質疫苗要更加顯著，具備較好的研究開發(fā)潛力。

2 LPS

近些年來，布魯氏菌如脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）成為研制布魯氏菌亞單位疫苗的備選物。從先天免疫的角度來看，布魯氏菌脂多糖被認為是最重要的抗原之一。

Siadat等[8]設計出用牛型布魯氏菌S99的脂多糖和血清組B類腦膜炎雙球菌的外膜囊泡進行共軛結合來構成布病亞單位疫苗，實驗結果顯示，注射LPS-外膜囊泡（outer membrane vesicles,OMVS）共軛物后，機體產生的IgG效價明顯高于單獨LPS和LPS與OMV非共價鍵聯(lián)合。在隨后的加強免疫研究中，相對于其他參照組，LPS-OMV共軛物都顯示出更強的效價，實驗結果證明共軛的LPS可以作為布病疫苗，但仍須要更深入的調查研究。關于脂多糖作為軛合物的成分的使用，受到很多因素的影響，這些因素主要包括共軛的成分、蛋白質載體、免疫接種路徑、佐劑、動物物種和檢測方法等[9]，都可以致使體內發(fā)生差異性的抗體反應。Rokhsartalab-Azar等[10]設計出了以LPS為基礎的共軛疫苗，報道了這些共軛化合物在實驗小鼠體內引起的高濃度抗體反應。這些研究均顯示了LPS作為共軛物成分研制出新布病共軛物疫苗的可行性以及有效性，但仍需要進一步的研究。

3 蛋白質疫苗

當前用于布魯氏菌病亞單位疫苗研究的蛋白包含有轉鐵蛋白Bfr、外膜蛋白、分子伴侶DnaK、Cu-Zn超氧化物歧化酶、水解酶、糖激酶等[11-12]。許多針對蛋白質的重組疫苗研究已經開展，也取得相應的成效。構建重組蛋白質疫苗的關鍵是挑選出最佳的抗原，后期常與各種佐劑結合起來使用，能刺激機體產生免疫應答反應，相比之前而言，反應更加強烈。實驗研究結果顯示，Omp16和Omp19在一定程度上都能夠刺激機體，使其產生Th1型的免疫反應，且能夠提供與現(xiàn)有疫苗S19和RB51相當?shù)谋Ｗo作用。此外，對外膜蛋白Omp25、Omp28和Omp31的開展研究，也獲得類似的成果[13-16]。隨著重組蛋白疫苗研究的進一步深入，相信布魯氏菌的膜外蛋白具有為其研究提供合適目標蛋白的潛力。

隨著對外膜蛋白研究的進一步深入，多肽疫苗作為一種新型疫苗被研發(fā)出來，免疫效果優(yōu)良。同時，隨著網絡技術的發(fā)展，免疫信息學分析作為一種新型標準的篩選細胞抗原表位的手段，已經被各種實驗研究大量采用。Saadi等[17]應用免疫信息學篩選出了布魯氏菌 最有效 的免疫原性 抗 原 Omp31、BP26、BLS、DnaK和L7-L12，并從這些蛋白中選出了5個新的T細胞表位，以預測的377個氨基酸殘基表位為基礎設計出了多肽疫苗，實驗結果表明，設計出的多肽疫苗可引起強烈的T細胞和B細胞介導的免疫反應。

雖然免疫信息學預測工具存在預測表位準確性差的問題，但是現(xiàn)有的表位預測工具較多，通過多個預測工具的聯(lián)合可以很好的增加預測的準確性。本課題組聯(lián)合利用BepiPred、ABCpred和COBEpro 3個B細胞表位預測工具，對多個布魯氏菌外膜蛋白進行了預測，構建了多表位融合蛋白，通過動物試驗，取得了很好的免疫效果，此外，T細胞表位預測工具，可以對Ⅰ和Ⅱ型主要組織相容性復合體進行預測，同時結合NetMHC version、SMM 和 Comblib等多個工具的預測結果[18]，都能夠篩選合適表位進行融合處理，可用于研制構建融合蛋白疫苗，實現(xiàn)多價的疫苗的構建，研究結果表明，融合蛋白有望致力于提高布病疫苗的免疫效力。

與其他亞單位疫苗相對比而言，蛋白質疫苗研制的費用過高、體內無法合成并且提取程序復雜，眼下并未被大規(guī)模廣泛使用。目前，構建蛋白質疫苗常見的策略是將幾種蛋白，或者將多個有效的多肽進行重組，構建重組蛋白，用于布魯氏菌疫苗的研究，該方法既可以解決多肽疫苗的半抗原缺陷，又可以增加免疫效果。

4 展望

對于亞單位疫苗的研究，只有選擇合適的抗原，才能有望提高亞單位疫苗的效果，雖然很多研究已經證實了多數(shù)細菌外膜以及內部的要素，在一定程度上都可以具有作為亞單位疫苗研究的靶器官抗原的可能性，但是需要更多進一步的研究，不斷探索發(fā)現(xiàn)新的具有保護作用的抗原，這一點對于致力于提高亞單位疫苗效力顯得不可或缺[19]。

目前布魯氏菌回升趨勢仍波動不穩(wěn)，尚未被完全消滅掉。不單單畜牧養(yǎng)殖業(yè)因此遭受極大虧損，而且人類的健康也難以得到保障，而疫苗是其治療的最好選擇。相對于傳統(tǒng)的疫苗，亞單位疫苗安全性較高，并且無潛伏毒副作用。此外，亞單位疫苗誘導發(fā)生的免疫反應不同于受到感染所致的免疫反應，更加適合于控制和預防疾病。但是目前的亞單位疫苗仍存在著保護效果不完全的缺點，因此有針對性地選擇合適的保護性抗原，并且對特定的抗原，可以選擇契合的載體及輔助性的佐劑，另外，高效率的加工處理系統(tǒng)也很重要，這些都致力于提高亞單位疫苗的保護效力，充分發(fā)揮其優(yōu)勢所在，這將會是未來布病亞單位疫苗研究的新方向。

[1]Saadi M,Karkhah A,Nouri HR,et al.Development of a multi-epitope peptide vaccine inducing robust T cell responses against brucellosis using immunoinformatics based approaches[J].Infect Genet Evol,2017,51:227-234.

[2]白旭華,呂昌龍.布魯菌致病特點和疫苗的研究新進展[J].微生物學雜志,2013,33(3):81-85.

[3]Olsen SC.Recent developments in livestock and wildlife brucellosis vaccination[J].Rev Sci Tech,2013,32(1):207-217.

[4]Jain S,Afley P,Dohre SK.Evaluation of immunogenicity and protective efficacy of a plasmid DNA vaccine encoding ribosomal protein L9 of Brucella abortus in BALB/c mice[J].Vaccine,2014,32:4537-4542.

[5]定家波,馮忠武.動物布魯氏菌病疫苗應用現(xiàn)狀及研究進展[J].生命科學,2013,25(1):91-99.

[6]Soheil Y,Mojtaba T,Mohammad HS,et al.Cloning,expression and molecularanalysisofIranian Brucella melitensis Omp25 gene for designing a subunit vaccine[J].Research in Pharmaceutical Sciences,2016,11(5):412-418.

[7]Golshani M,Rafati S,Siadat SD,et al.Improved immunogenicity and protective efficacy of a divalent DNA vaccine encoding Brucella L7/L12-truncated Omp31 fusion protein by a DNA priming and protein boosting regimen[J].Mol Immunol,2015,66:384-391.

[8]Siadat SD,Vaziri F,Eftekhary M,et al.Preparation and Evaluation of a New Lipopolysaccharide-based Conjugate as a Vaccine Candidate for Brucellosis[J].Osong Public Health Res Perspect,2015,6(1):9-13.

[9]Kheirandish M,Siadat SD,Norouzian D,et al.Measurement of opsonophagocytic activity of antibodies specific to Neisseria meningitidis serogroup A capsular polysaccharide-serogroup B outer membrane vesicle conjugate in animal model[J].Annals of Microbiology,2009,59(4):801-806.

[10]Rokhsartalab-Azar S,Shapouri R,Rahnema M,et al.Synthesis,characterization and immunological properties of Escherichia coli 0157:H7 lipopolysaccharide-diphtheria toxoid conjugate vaccine [J].Iran J Microbiol,2015,7:150-155.

[11]王真,HAN Gilsu，吳清民，等.動物布魯氏菌病疫苗的來歷及亞單位疫苗的研究概況[J].中國農業(yè)大學學報,2014,19(3):169-174.

[12]Escalona E,Saez D,Onate A.Immunogenicity of a Multi-Epitope DNA Vaccine Encoding Epitopes from Cu-Zn Superoxide Dismutase and Open Reading Frames of Brucella abortus in Mice[J].Front Immunol,2017,8:125.

[13]Abkar M,Lotfi AS,Amani J,et al.Survey of Omp19 immunogenicity againstBrucella abortusand Brucella melitensis:influence of nanoparticulation versus traditional immunization[J].Vet Res Commun,2015,39:271-28

[14]Du ZQ,Wang JY.A novel lumazine synthase molecule from Brucella significantly promotes the immune-stimulation effects of antigenic protein[J].Genet Mol Res,2015,14:13084-130095.

[15]Karothia BS,Athmaram TN,D T.Fed batch fermentation and purification strategy for high yield production of Brucella melitensis recombinant Omp 28 kDa protein and its application in disease diagnosis[J].Protein Pept Lett,2013，20:731-740.

[16]吳倩倩,馮佳佳,孫銘艷,等.布魯氏菌OMP25的表達、純化、鑒定及多克隆抗體的制備[J].中國病原生物學雜志,2017,12(6):509-512，518.

[17]Saadi M,Karkhah A,Nouri HR.Development of a multi-epitope peptide vaccine inducing robust T cell responsesagainstbrucellosisusing immunoinformatics based approaches[J].Infect Genet Evol，2017，51:227-234[18]Yin DH,Li L,Song DD,et al.A novel recombinant multi-epitope protein against Brucella melitensis infection[J].Immunology Letters,2016,175:1-7.

[19]Gomez G,Adams LG,et al.Host-Brucella interactions and the Brucella genome as tools for subunit antigen discovery and immunization against brucellosis[J].Front cell Infect Microbiol,2013,3:17.