顧偉鳴

（上海市皮膚病醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200443）

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）是一種細(xì)胞內(nèi)寄生的微小微生物，分為小鼠生物型、沙眼生物型和性病淋巴肉芽腫生物型，后2種與人類疾病有關(guān)，可引起人類泌尿生殖道感染，如男性尿道炎、附睪炎，以及女性宮頸炎、盆腔炎、宮內(nèi)感染等，孕婦生殖道感染Ct可導(dǎo)致新生兒眼炎和肺炎[1]。世界衛(wèi)生組織估計(jì)每年有1.31億新感染者[2-3]。美國(guó)疾病與預(yù)防控制中心2016年報(bào)告Ct新發(fā)病例達(dá)159萬(wàn)例，較2015年增長(zhǎng)了4.7%[4]。我國(guó)105個(gè)性病監(jiān)測(cè)點(diǎn)報(bào)告生殖道Ct感染發(fā)病率由2008年的32.48/10萬(wàn)增長(zhǎng)到2015年的37.18/10萬(wàn)，年均增長(zhǎng)1.95%[5]。生殖道Ct感染已經(jīng)成為全球重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[2-5]。

1 Ct檢測(cè)方法

Ct感染是我國(guó)國(guó)家監(jiān)測(cè)病種之一。由于Ct感染的潛伏期長(zhǎng)、臨床表現(xiàn)和癥狀不典型，主要以實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果作為臨床診斷依據(jù)。Ct檢測(cè)方法主要有3種：細(xì)胞培養(yǎng)法、分子生物學(xué)方法和免疫學(xué)方法。細(xì)胞培養(yǎng)法是傳統(tǒng)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，然而其操作復(fù)雜，需要高水平的專業(yè)技術(shù)人員，目前僅有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行科學(xué)研究時(shí)采用。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)理論和檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，分子生物學(xué)方法無(wú)論在敏感性還是特異性方面，都超越了細(xì)胞培養(yǎng)方法和免疫學(xué)方法，被認(rèn)為是替代的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但是從實(shí)驗(yàn)室技術(shù)能力和質(zhì)量監(jiān)管的角度看，開展分子生物學(xué)方法需要技術(shù)準(zhǔn)入門檻和特定的實(shí)驗(yàn)室及設(shè)備條件，短時(shí)間內(nèi)無(wú)法在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)普及。而免疫學(xué)方法，尤其是免疫層析法檢測(cè)技術(shù)，由于操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)周期快、特異性較好等優(yōu)勢(shì)，在全國(guó)各地不同級(jí)別的醫(yī)療機(jī)構(gòu)中普遍開展。截止到2018年3月，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局的網(wǎng)站顯示有3種檢測(cè)衣原體抗體和10余種檢測(cè)衣原體抗原的免疫層析法試劑盒，1種直接免疫熒光法試劑盒。本文主要介紹以抗原為靶標(biāo)的Ct免疫層析法檢測(cè)技術(shù)的特點(diǎn)和應(yīng)用價(jià)值。

2 免疫層析法分類

免疫層析技術(shù)（immunochromatography assay，ICA）是20世紀(jì)80年代初發(fā)展起來(lái)的一種基于抗原抗體特異性免疫應(yīng)答的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)細(xì)胞或樣本中的多糖、糖蛋白、蛋白質(zhì)、多肽、激素和核酸等生物大分子進(jìn)行定位及定性檢測(cè)，匯集了免疫檢測(cè)、標(biāo)記、層析等綜合學(xué)科技術(shù)。根據(jù)示蹤標(biāo)記物將ICA分為免疫膠體金技術(shù)（immune colloidal gold technique，ICGT）和免疫乳膠技術(shù)（immune latex technique，ILT）。

ICA按層析過(guò)程液體流動(dòng)方向分為垂直流向的免疫滲濾分析（dot immunofiltrtion assay，DIFA）和水平流向的免疫層析分析（dot immuno-chromatography assay，DICA）。免疫層析將已知靶標(biāo)的特異性抗體（單抗或多抗）包被于硝酸纖維素膜上的特定位置作為檢測(cè)帶（T），可捕獲免疫復(fù)合物的二抗包被于臨近位置作為質(zhì)控帶（C），標(biāo)記了示蹤顆粒的特異性抗體（單抗標(biāo)記結(jié)合物）附于樣品滴加墊上并干燥。檢測(cè)時(shí)，樣本中的水分可溶解單抗標(biāo)記結(jié)合物，若樣本中有待測(cè)抗原，則會(huì)發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，形成的免疫復(fù)合物A（標(biāo)記抗體-抗原）借助毛細(xì)管作用向吸水墊方向移動(dòng)，到達(dá)T位置時(shí)，被特異性抗體捕獲形成復(fù)合物B（標(biāo)記抗體-抗原-包被抗體），在T位置聚集形成肉眼可見的免疫復(fù)合物條帶；若樣本中無(wú)待檢抗原，則不能形成肉眼可見的免疫復(fù)合物條帶。游離的標(biāo)記抗體或復(fù)合物A越過(guò)T到達(dá)C，與二抗發(fā)生反應(yīng)，形成復(fù)合物D（標(biāo)記抗體-二抗）或復(fù)合物E（復(fù)合物A-二抗），聚集并產(chǎn)生肉眼可見的免疫復(fù)合物條帶，提示檢測(cè)有效。

2.1 ICGT

ICGT是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物檢測(cè)抗原的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸在還原劑如白磷、維生素C、枸櫞酸鈉或鞣酸等的作用下，聚合成為穩(wěn)定、特定大小、膠體狀態(tài)的納米金顆粒。球形的納米金顆粒對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附能力，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而被應(yīng)用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)。

2.2 ILT

ILT以紅色乳膠微球作為示蹤物來(lái)標(biāo)記抗體，制成特異性試劑。由羧基修飾的聚苯乙烯微球表面呈高度疏水性，與配體最大程度結(jié)合。乳膠微球被清洗、稀釋和活化后，利用1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亞胺和乳膠微球上的羧基耦合形成一個(gè)O-異酰基脲結(jié)構(gòu)，這一活化中間物與抗體上的-NH2基團(tuán)形成酰胺交聯(lián)，再利用N-基琥珀酰亞胺形成更穩(wěn)定的交聯(lián)產(chǎn)物，被用于定性或者半定量衣原體抗原檢測(cè)。

3 Ct-ICA臨床應(yīng)用

Ct- ICA采用抗衣原體脂多糖單克隆抗體檢測(cè)Ct。由于是針對(duì)衣原體屬的抗原，理論上檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果涵蓋了所有衣原體屬的感染。從性傳播感染（sexually transmitted infection，STI）流行病學(xué)特征來(lái)看，引起泌尿生殖道感染的主要是Ct D～K血清型，以及在我國(guó)少見的可引起性病性淋巴肉芽腫的L血清型[1]。

鑒于Ct抗原檢測(cè)的樣本為泌尿生殖道的分泌物，含有較多未知蛋白和雜質(zhì)，因此泌尿生殖道Ct的檢測(cè)試劑采用雙抗體夾心ICA。隨著現(xiàn)代即時(shí)診斷（point-of-care testing，POCT）標(biāo)記技術(shù)和放大技術(shù)的飛速進(jìn)步[6]，臨床普遍采用Ct-POCT開展常規(guī)的診療，世界衛(wèi)生組織推薦在高危人群中采用POCT篩查STI，以期達(dá)到早期診斷、及時(shí)治療、阻斷傳染源的目的[7]。

2006年，美國(guó)國(guó)家生物醫(yī)學(xué)影像和生物工程研究所提出了一項(xiàng)全國(guó)性倡議：POCT對(duì)于解決資源緊張地區(qū)和貧窮國(guó)家性傳播疾病的流行具有巨大的潛力[8]。ROMPALO等[9]在2008年3月—2009年4月對(duì)美國(guó)馬里蘭州巴爾的摩市和俄亥俄州辛辛那提市的STI患者進(jìn)行定性檢測(cè)，檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)便和結(jié)果易于讀取的POCT得到了他們的青睞。POCT具有更好的保密性、隱私性和便利性，不僅方便家庭使用，也可以應(yīng)用于臨床，醫(yī)生可以根據(jù)陽(yáng)性結(jié)果立即開展治療。2010年4月—2011年2月在巴爾的摩市招募了154名婦女進(jìn)行衣原體檢測(cè)，Ct-POCT的敏感性達(dá)到92.9%，測(cè)試成本為33.48美元，比核酸擴(kuò)增技術(shù)（nucleic acid amplification technique，NAAT）更高效，費(fèi)用更低[10-11]。HSIEH等[12]對(duì)218名美國(guó)性病?？漆t(yī)生進(jìn)行的調(diào)查結(jié)果表明，POCT是性傳播疾病門診首選的檢測(cè)方法，而檢測(cè)的敏感性是性病?？漆t(yī)生關(guān)心的首要問(wèn)題。

我國(guó)Ct-POCT的臨床應(yīng)用始于20世紀(jì)90年代初，由于衣原體感染問(wèn)題日益受到重視，進(jìn)入21世紀(jì)后，特別是近年來(lái)，我國(guó)放開“二孩”政策，育齡婦女的生殖道Ct感染關(guān)乎下一代健康問(wèn)題[13]，Ct-POCT無(wú)論在普及范圍還是在使用數(shù)量方面，都達(dá)到了前所未有的程度。但是大量臨床實(shí)踐表明，Ct-ICA檢測(cè)敏感性低的問(wèn)題逐步成為我國(guó)衣原體感染診斷重要的影響因素。臨床評(píng)估發(fā)現(xiàn)，一個(gè)進(jìn)口品牌Ct-ICA試劑檢測(cè)女性宮頸樣本的敏感性只有49.3%[14]，而另外一個(gè)進(jìn)口品牌Ct-ICA檢測(cè)男性尿道樣本的敏感性僅57.14%[15]。DOMMELEN等[16]在2008年對(duì)772位女性的自采樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，以核酸檢測(cè)方法為參照，3個(gè)品牌Ct-ICA的檢測(cè)敏感性為12%～27%。HISLOP等[17]發(fā)現(xiàn)Ct-ICA檢測(cè)宮頸樣本的敏感性為39%～65%，檢測(cè)男性首段尿樣本的敏感性為47%～77%。HUPPERT等[18]系統(tǒng)分析了4個(gè)國(guó)際知名Ct-ICA品牌的9份臨床評(píng)估報(bào)告中5 287例女性宮頸樣本，結(jié)果顯示：在女性人群中，這4種Ct-ICA檢測(cè)試劑的檢測(cè)敏感性為25%～95%。

隨著現(xiàn)代生物醫(yī)藥技術(shù)的進(jìn)步，一種改良Ct-ICA的檢測(cè)敏感性有了很大程度的提升[19]，采用脂多糖抗原優(yōu)勢(shì)表位嵌合重組蛋白誘導(dǎo)衣原體種屬特異性抗體，其中1個(gè)抗體用于固相包被，2個(gè)抗體標(biāo)記膠體金探針，通過(guò)增加衣原體抗原捕捉能力達(dá)到提高檢測(cè)敏感性的目的。有研究結(jié)果表明，改良Ct-ICA檢測(cè)女性高危人群的敏感性接近聚合酶鏈反應(yīng)，檢測(cè)男性高危人群的敏感性為73.2%[19]，比蔣娟等[15]的研究結(jié)果提升了16%，而在低危人群中，改良Ct-ICA的檢測(cè)敏感性與聚合酶鏈反應(yīng)仍然有較大差距[19]。另一項(xiàng)對(duì)英國(guó)1 349例性病門診女性患者采用Ct-ICA進(jìn)行檢測(cè)的研究結(jié)果表明，同樣以核酸檢測(cè)做為參比方法，Ct-ICA的檢測(cè)敏感性高達(dá)81.6%～83.5%[20]。

以往的臨床應(yīng)用評(píng)估有以下特點(diǎn)：（1）不同報(bào)道的應(yīng)用評(píng)估研究時(shí)間跨度近30年，正處于免疫標(biāo)記技術(shù)和生物工程技術(shù)快速發(fā)展的階段，Ct-ICA試劑質(zhì)量不可同日而語(yǔ)；（2）研究對(duì)象有高危和/或低危人群，每項(xiàng)研究的樣本量差異懸殊，敏感性為25%～95%。提示Ct-ICA適用范圍具有局限性；（3）每項(xiàng)研究都是采用一種待評(píng)估Ct- ICA試劑與細(xì)胞培養(yǎng)法和/或核酸檢測(cè)法相比較的方式，其中一些研究?jī)H僅是臨床檢測(cè)結(jié)果的回顧性分析。沒(méi)有1項(xiàng)研究是在相同背景下對(duì)不同Ct-ICA試劑進(jìn)行的平行評(píng)估；（4）對(duì)于不同研究人群，Ct-ICA抗原檢測(cè)的特異性都超過(guò)95%。提示Ct-ICA檢測(cè)特異性好，但敏感性因試劑品牌和檢測(cè)人群不同而差異較大。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，泌尿生殖道Ct-ICA是各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)普遍采用的方法，特別是對(duì)高危人群的檢測(cè)在防控衣原體感染蔓延工作中有著重要的價(jià)值。隨著生物醫(yī)藥技術(shù)革命性的進(jìn)步，Ct-ICA試劑質(zhì)量有了較大的提高。但由于試劑的原料和生產(chǎn)工藝等因素影響，不同品牌Ct-ICA試劑檢測(cè)性能差異較大，目前為止未發(fā)現(xiàn)關(guān)于Ct-ICA的系統(tǒng)性評(píng)價(jià)。我們?cè)谛圆z測(cè)室間質(zhì)評(píng)中也發(fā)現(xiàn)了不同品牌檢測(cè)試劑敏感性差異顯著的問(wèn)題。有必要制定專門的Ct-ICA檢測(cè)性能的評(píng)估方案，以系統(tǒng)了解我國(guó)Ct-ICA現(xiàn)狀，推薦臨床適用范圍和路徑。