汪林嬌　劉子杰　趙瀅

[摘要]目的探討EB病毒感染對(duì)結(jié)核感染T細(xì)胞試驗(yàn)的影響。方法選取2015年1～12月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院疑似結(jié)核感染的患者246例，采集外周血同時(shí)進(jìn)行結(jié)核感染T細(xì)胞試驗(yàn)和EB病毒核酸檢測(cè)，分析結(jié)核感染T細(xì)胞試驗(yàn)的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性似然比和陰性似然比。結(jié)果結(jié)核感染T細(xì)胞試驗(yàn)的靈敏度為83.87%，特異性為93.49%，準(zhǔn)確度為92.27%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為65%、陰性預(yù)測(cè)值為97.57%，陽(yáng)性似然比為12.88，陰性似然比0.17，約登指數(shù)為0.77。EB病毒再激活與結(jié)核感染性T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)間有顯著性差異（P=0.021<0.05）。結(jié)論結(jié)核感染T細(xì)胞試驗(yàn)對(duì)結(jié)核感染的診斷特異性較高，具有較好的臨床應(yīng)用性能，EB病毒再激活會(huì)影響結(jié)核感染T細(xì)胞試驗(yàn)。

[關(guān)鍵詞]結(jié)核；結(jié)核感染T細(xì)胞試驗(yàn)；EB病毒；γ干擾素

[中圖分類(lèi)號(hào)]R446.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]2095-0616（2017）17-168-04

我國(guó)是結(jié)核病高發(fā)國(guó)家之一，據(jù)2010年全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)估算，全國(guó)≥15歲人口中活動(dòng)性肺結(jié)核患者高達(dá)499萬(wàn)，盡管活動(dòng)性肺結(jié)核的患病率有所下降，但由于人口數(shù)量增加，實(shí)際患肺結(jié)核的人數(shù)較2000年反而有所增加。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，結(jié)核病診斷率僅為37%，結(jié)核病診斷率低的主要原因是很難找到病原學(xué)證據(jù)，即使在發(fā)達(dá)國(guó)家結(jié)核病的診斷也僅有50%具有細(xì)菌學(xué)證據(jù)支持。因此，尋求一個(gè)敏感度及特異度均較高的非病原學(xué)檢測(cè)方法具有重要的臨床意義。結(jié)核感染T細(xì)胞試驗(yàn)（T-SPOT.TB）是（ELISPOT）檢測(cè)結(jié)核感染的新方法，該試驗(yàn)是以結(jié)核桿菌特異性抗原刺激T細(xì)胞，如果患者感染過(guò)結(jié)核桿菌則會(huì)釋放γ干擾素，從而可以通過(guò)ELISPOT技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。T-SPOT.TB試驗(yàn)的檢測(cè)主要通過(guò)抗原刺激記憶性T細(xì)胞釋放γ干擾素，因此影響γ干擾素釋放的因素可能會(huì)對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)EB病毒能抑制干擾素的生成，EB病毒的一種蛋白具有類(lèi)似ILl0的功能，它能抑制IFN-γ的合成和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，因此EB病毒感染可能會(huì)對(duì)結(jié)核感染T細(xì)胞試驗(yàn)造成影響，本文擬分析結(jié)核感染T細(xì)胞試驗(yàn)的臨床性能并評(píng)價(jià)EB病毒感染對(duì)此實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的影響。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2015年1～12月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院疑似結(jié)核患者267例，收集每位患者臨床資料以及既往結(jié)核病史、結(jié)核接觸史、以及其他疾病和治療史。根據(jù)肺結(jié)核診斷和治療指南，根據(jù)臨床資料確診結(jié)核患者31例，其中男性18例，女性13例，年齡中位數(shù)32.5歲。排除結(jié)核病人215例，其中男性131例，女性84例，年齡中位數(shù)37歲。EB病毒感染組，EB-DNA≥400拷貝/mL12例，其中9例確診結(jié)核。

1.2T-SPOT.TB檢測(cè)方法

采用T-SPOT.TB試劑盒（英國(guó)牛津），根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 EB-DNA定量檢測(cè)

熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司（ABI-7300），全血DNA基因提取試劑購(gòu)自天隆科技公司，EB-DNA定量檢測(cè)試劑購(gòu)自湖南圣湘科技有限公司。DNA提取和擴(kuò)增均按廠家試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 ELISA法檢測(cè)抗-EA IgG

用德國(guó)IBL公司的成套試劑盒，按說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定的吸光度，抗-EA IgG的吸光度值>0.5為陽(yáng)性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)算靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性似然比、陰性似然比采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用x²檢驗(yàn)，當(dāng)觀察例數(shù)小于4例時(shí)采用Fisher精確概率計(jì)算，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1T-SPOT.TB試驗(yàn)的臨床性能評(píng)價(jià)

結(jié)果表明T-SPOT.TB試驗(yàn)的靈敏度為83.87%，特異性為93.49%，準(zhǔn)確度為92.27%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為65%、陰性預(yù)測(cè)值為97.57%，陽(yáng)性似然比為12.88，陰性似然比0.17，約登指數(shù)為0.77。見(jiàn)表1。

2.2EB病毒載量對(duì)T-SPOT.TB試驗(yàn)的影響

EB病毒感染組和非感染組間T-SPOT檢測(cè)結(jié)果間無(wú)顯著影響（P=0.697）。見(jiàn)表2。以抗-EA為EB病毒再激活的標(biāo)記，結(jié)果表明EB病毒再激活與T-SPOT檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

3討論

人體初次感染結(jié)核分枝桿菌后，外周血中的T細(xì)胞發(fā)生致敏轉(zhuǎn)化，形成記憶性T淋巴細(xì)巴細(xì)胞，當(dāng)再次接觸結(jié)核分枝桿菌時(shí)，記憶性T淋巴細(xì)胞能夠迅速活化增殖，從而引起γ干擾素釋放。T-SPOT.TB法即是基于以上原理，以ESAT-6（Rv3875）和CFP-10（Rv3874）肽段庫(kù)作為刺激原，檢測(cè)外周血中具有促進(jìn)γ干擾素釋放的T淋巴細(xì)胞，從而反映是否感染過(guò)結(jié)核分枝桿菌。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)T-SPOT.TB對(duì)肺結(jié)核診斷的敏感度為80%～90%，特異性大于90%，對(duì)于肺外結(jié)核診斷靈敏度可達(dá)83%～91.7%，特異度可達(dá)76.5%～85%。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，T.SPOT.TB診斷結(jié)核病具有較高的敏感度和特異度。Pai等對(duì)免疫力正常的726例研究對(duì)象進(jìn)行分析，結(jié)果表明T-SPOT.TB的綜合敏感性為90%本文研究結(jié)果表明T-SPOT.TB試驗(yàn)的靈敏度為80.95%，特異性為93.49%，陽(yáng)性似然比為12.4，陰性似然比0.2，約登指數(shù)為0.74，與之前研究報(bào)道的結(jié)果一致。陽(yáng)性似然比是檢驗(yàn)結(jié)果的真陽(yáng)性率與假陽(yáng)性率之比，說(shuō)明試驗(yàn)正確判斷陽(yáng)性的可能性是錯(cuò)誤判斷陽(yáng)性可能性的倍數(shù)，比值越大，試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性時(shí)為真陽(yáng)性的概率越大。因此，本文所得結(jié)果表明該試驗(yàn)具有較好的區(qū)分患者與非患者的能力。靈敏度和特異性是一對(duì)矛盾對(duì)立體，它與診斷閾值有關(guān)，而在臨床工作中最關(guān)注的是該檢驗(yàn)結(jié)果的陽(yáng)性或陰性的價(jià)值，是否能診斷或排除某疾病，因此陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)值顯得比較重要，據(jù)報(bào)道云南的結(jié)核發(fā)病率約為52/10萬(wàn)，因此如果一個(gè)普通的患者得到陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，該方法的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為0.07%，而陰性預(yù)測(cè)值可達(dá)99.999%，這說(shuō)明對(duì)于普通人群該方法具有很高的排除價(jià)值，而診斷價(jià)值較小，而在醫(yī)院就診的患者，其結(jié)核的發(fā)病率顯著高于普通人群，本文的研究對(duì)象均具有結(jié)核病相應(yīng)體征或影象學(xué)表現(xiàn)，該人群中結(jié)核患病率為15.7%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為69.8%，陰性預(yù)測(cè)值為98.7%，由此可見(jiàn)，當(dāng)待檢人群的患者率升高時(shí)其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值可顯著升高，因此若將此方法與指南中診斷標(biāo)準(zhǔn)中的一條或幾條聯(lián)合應(yīng)用，如典型的肺結(jié)核臨床癥狀和胸部x線表現(xiàn)、抗結(jié)核治療有效、肺外組織病理證實(shí)結(jié)核病變等則可顯著提高該方法的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。此外，本文結(jié)果也顯示該方法具有較高的陰性預(yù)測(cè)值，采用此方法排外肺結(jié)核具有重要價(jià)值。

當(dāng)前全球有1/3的人感染結(jié)核，每年新發(fā)病例約800萬(wàn)，結(jié)核仍是全世界導(dǎo)致死亡人數(shù)最多的疾病。目前針對(duì)結(jié)核的病原學(xué)診斷主要依靠抗酸染色和分離培養(yǎng)，分離培養(yǎng)是臨床診斷結(jié)核感染的主要依據(jù)之一，但分離培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，檢出率相對(duì)較低，不利于結(jié)核病的早期診斷與治療?；赑CR的擴(kuò)增方法靈敏度和特異性較高，但因標(biāo)本原因?qū)е聶z出率仍不理想，血清學(xué)結(jié)核抗體檢測(cè)操作相對(duì)方便、快速，可作為輔助診斷的方法，但缺乏特異性和敏感性。T-SPOT.TB試驗(yàn)采用結(jié)核桿菌特異性抗原進(jìn)行檢測(cè)，可避免卡介苗所引起的交叉反應(yīng)，可較好解決疫苗接種所帶來(lái)的影響，該方法具有較高的敏感性和特異性。此外，該方法采用血液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，避免了標(biāo)本采集的影響，有利于臨床操作與保證結(jié)果的一致性。

T-SPOT.TB試驗(yàn)的最終檢測(cè)物為γ干擾素，因此影響γ干擾素釋放的因素可能會(huì)對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。因此高載量的EB病毒可能會(huì)干擾IFN-γ的生成與釋放。而本文的結(jié)果表明以400拷貝/mL為cutoff值進(jìn)行分析，EB病毒對(duì)T-SPOT.TB檢測(cè)無(wú)顯著影響。可能存在以下幾方面原因，首先，本文中研究對(duì)象偏少，可能對(duì)結(jié)果有影響，下一步工作中應(yīng)擴(kuò)大樣本量進(jìn)行分析，其次EB病毒為人群感染率較高的病毒，以400拷貝/mL為閾值進(jìn)行判斷，則只要感染過(guò)該病毒的患者均可能為陽(yáng)性，而在潛伏狀態(tài)下可能對(duì)γ干擾素釋放沒(méi)有影響。為研究EB病毒是否在再激活狀態(tài)下對(duì)γ干擾素釋放產(chǎn)生影響，文獻(xiàn)報(bào)道抗-EA抗體可作為EB病毒再激活的標(biāo)記。我們采用抗-EA抗體作為再激活的標(biāo)志，結(jié)果表明抗-EA與結(jié)核感染性T細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果間有顯著性的差異，因此結(jié)果表明EB病毒在再激活狀態(tài)下可能會(huì)對(duì)結(jié)核感染性T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)造成影響，但有文獻(xiàn)報(bào)道EB病毒主要是對(duì)CD8+的細(xì)胞干擾素生成產(chǎn)生影響，是否對(duì)記憶型T細(xì)胞干擾素的生成有影響尚需進(jìn)一步研究，同時(shí)本研究研究病例相對(duì)較少，如果擴(kuò)大樣本量可能會(huì)更能證實(shí)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果；此外，雖然我們發(fā)現(xiàn)抗EA陽(yáng)性與陰性組與結(jié)核感染性T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)間存在顯著差異，但沒(méi)有直接證據(jù)表明此是因?yàn)镋B病毒再激活而造成的，但是否更高的病毒載量對(duì)T-SPOT.TB試驗(yàn)有影響有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

（收稿日期：2017-06-21）