姚協(xié)豐，李蘋芳，朱凌麗，徐錦華，張 曼，任潤生，劉 廣，侯 茜，羊杏平

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所 江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇 南京 210014)

甜瓜(CucumismeloL.)是一種重要的葫蘆科作物，世界前八大水果之一。我國甜瓜種植面積和產(chǎn)量分別占世界總量的45%和55%以上，因其經(jīng)濟(jì)效益顯著，在設(shè)施農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位[1]。葫蘆科鏈格孢葉斑病(Alternariaalternata(Fr.) Keissler)，又稱葉枯病，危害植物葉片、莖蔓和果實等部位，田間以葉片發(fā)病為主[2]。研究表明，鏈格孢葉斑病發(fā)病范圍廣，涉及葫蘆科多種作物，如黃瓜、西瓜、南瓜、甜瓜、西葫蘆、苦瓜、絲瓜、瓠瓜、冬瓜等主要瓜類作物。以甜瓜為例，近年來在新疆、上海、北京、甘肅等地甜瓜作物均發(fā)生嚴(yán)重的鏈格孢葉斑病，由于發(fā)病后的植株葉片干枯死亡，對甜瓜生產(chǎn)造成嚴(yán)重的影響[2-5]。前期我們對江蘇南京地區(qū)甜瓜葉斑病進(jìn)行初步調(diào)查發(fā)現(xiàn)，南京地區(qū)甜瓜生產(chǎn)區(qū)域有典型的甜瓜鏈格孢葉斑病癥狀病株，田間發(fā)病率達(dá)到30%，危害嚴(yán)重。

生產(chǎn)上化學(xué)防治是葉部病害最主要的防治方法，但長期使用化學(xué)農(nóng)藥極易使病原菌產(chǎn)生抗性，且對環(huán)境與人類身體健康均危害很大[6]。因此選育抗病品種是防治鏈格孢葉斑病最根本、最有效的方法。但是目前國內(nèi)尚未有系統(tǒng)開展甜瓜抗鏈格孢葉斑病抗性的研究。為此，建立可靠的鏈格孢葉斑病鑒定方法，進(jìn)行甜瓜種質(zhì)資源對鏈格孢葉斑病抗性的評價，對于選育鏈格孢葉斑病抗性品種，從而克服或減輕鏈格孢葉斑病的危害，具有重要的實踐指導(dǎo)價值。本研究比較了活體接種與離體接種2種不同鏈格孢葉斑病菌的接種方法，通過對20份甜瓜種質(zhì)資源進(jìn)行接種鑒定，建立了穩(wěn)定可靠的鏈格孢葉斑病菌離體鑒定體系，2種方法同時篩選出5份具有中等抗性的甜瓜抗性資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2016年3—4月期間在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所玻璃溫室進(jìn)行，3月23日播種，4月20日接種，每個材料接種16株，同時取樣第3片真葉作為待檢測用的離體葉片，共取9片，4月26日、4月28日、4月29日統(tǒng)計病情。接種所用鏈格孢葉斑病菌[Alternariaalternata(Fr.) Keissler]菌株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究瓜類實驗室前期在田間病株收集、分離和致病性鑒定，因鏈格孢葉斑病菌株AlternariaalternateLH1601致病力強(qiáng)且穩(wěn)定性好，作為抗病性接種鑒定菌株。育苗基質(zhì)采用品氏進(jìn)口育苗基質(zhì)，滅菌處理后備用。

供試20份甜瓜材料由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所瓜類研究室自己選育并保存，材料名稱和來源見表1。

表1 供試甜瓜材料及來源

1.2 鏈格孢葉斑病菌培養(yǎng)及產(chǎn)孢

鏈格孢葉斑病菌分生孢子產(chǎn)孢方法。挑取LH1601的純性培養(yǎng)物接種于PDA固體培養(yǎng)基(20%土豆，2%葡萄糖，1.5%瓊脂)，置于26～28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。選取新鮮完整的甜瓜葉片，經(jīng)滅菌蒸餾水沖洗干凈后，再用75%酒精擦拭表面并晾干備用。用直徑0.7 cm的滅菌打孔器切取上述新鮮培養(yǎng)1周的菌塊，倒置于葉片正面，于28 ℃下培養(yǎng)。5～7 d后用刀片取下菌塊所在葉片，于研缽中研磨，并經(jīng)4層紗布過濾。濾液即為分生孢子液，顯微鏡下用血小球計數(shù)板計數(shù)并稀釋成5×105孢子·mL-1的孢子懸浮液用于噴霧接種。

1.3 室外苗期活體接種

參照Zhang等[7]的接種方法，在甜瓜長至3～4片真葉時，在植株正反面噴施預(yù)先配制好的5×105孢子·mL-1孢子懸浮液(含1% Tween 80)，直至葉片滴水為止。前3 d搭塑料拱棚保濕，保持相對濕度90%以上，3 d后揭開小拱棚，7、10 d調(diào)查統(tǒng)計病情。

葉片病級分級。0級為無可見病斑，1級為有疑似病斑，2級為病斑面積<10%，3級為10%≤葉斑面積<25%，4級為25%<葉片壞死面積≤50%，5級為葉片壞死面積>50%。

根據(jù)平均病情級別數(shù)(RI)確定鏈格孢葉斑病抗性級別。高抗(HR)，RI<1.0；抗(R)，1.0≤RI<2.0；中抗(MR)，2.0≤RI<3.0；感病(S)，3.0≤RI<4.0；高感(HS)，RI≥4.0。

平均病情級別數(shù)計算公式：

RI=Σ(級值×株數(shù))/總株數(shù)[6-7]。

1.4 離體葉片菌絲塊接種

離體葉片菌絲塊接種方法參照Wang等[8]方法稍做修改，取4 ℃冰箱保存的LH1601的純性培養(yǎng)物接種于PDA固體培養(yǎng)基，于26～28 ℃培養(yǎng)1周。取健康甜瓜植株第3～4片真葉，經(jīng)滅菌蒸餾水沖洗干凈，晾干后置于墊有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，葉片正面朝上。用0.5 cm的打孔器切取菌絲塊，正面朝下置于甜瓜葉片上，每張葉片左右兩邊各接1個菌絲塊。培養(yǎng)皿放在溫度(26±1)℃，16 h光照/8 h黑暗，相對濕度約90%的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每處理3張葉片，重復(fù)3次，5 d后測量菌絲塊周圍的菌絲侵染擴(kuò)展半徑。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SAS8.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。離體葉片菌絲塊接種的菌絲侵染擴(kuò)展半徑與活體接種鑒定后RI的相關(guān)性采用皮爾遜(Pearson)相關(guān)性分析方法(P≤0.05水平)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同甜瓜材料苗期活體接種鑒定抗病性

采用噴霧接種方法對20份甜瓜材料進(jìn)行鏈格孢葉斑病菌的室外活體接菌實驗，供試20個甜瓜材料接種4～7 d后均開始發(fā)病，葉部出現(xiàn)鏈格孢葉斑病典型癥狀，即葉片出現(xiàn)黃色小斑點，病斑性狀不規(guī)則，后期病斑逐漸擴(kuò)大，呈退綠褐色病斑(圖1)。不同材料間發(fā)病程度輕重有所不同，但未發(fā)現(xiàn)免疫材料，未接種對照均未發(fā)病。

圖1 苗期活體葉片接種甜瓜鏈格孢葉斑病發(fā)病情況

由表2和3可知，5份甜瓜材料發(fā)病相對較輕，表現(xiàn)為中抗，其RI在2～3，占總數(shù)的25%；表現(xiàn)感病的材料有5份，RI在3.6～3.9，占總數(shù)的25%；其余材料均表現(xiàn)為高感，平均病情級別數(shù)均≥4，表現(xiàn)對鏈格孢葉斑病較為敏感。

2.2 離體葉片菌絲塊接種鑒定不同甜瓜材料鏈格孢葉斑病抗性

表2 不同甜瓜材料苗期對鏈格孢葉斑病抗性鑒定結(jié)果

注：同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母表示差異顯著(P≤0.05)。

表3 甜瓜材料對鏈格孢葉斑病的抗性評價

將大小一致的菌絲塊接種于新鮮甜瓜葉片，觀察菌絲塊擴(kuò)展反應(yīng)，5 d后測量菌絲塊周圍的菌絲侵染擴(kuò)展半徑。如圖2所示，所選20份材料接種鏈格孢菌絲塊后周圍均有菌絲侵染生長。測量發(fā)現(xiàn)半徑從1.50～4.75 cm不等，各材料間菌絲侵染擴(kuò)展范圍大小差異顯著。如表2所示，其中5份材料侵染擴(kuò)展半徑≤2 cm，表現(xiàn)為中抗；5份甜瓜材料擴(kuò)展半徑均>2 cm，表現(xiàn)為感?。黄渌?0份甜瓜材料擴(kuò)展半徑≥4 cm，表現(xiàn)為高感。

圖2 苗期離體葉片接種甜瓜鏈格孢葉斑病發(fā)病情況

2.3 離體葉片菌絲塊接種與苗期活體接種鑒定比較相關(guān)性分析

為揭示離體葉片菌絲塊接種方法是否可替代活體接種法，采用SAS8.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析。表2結(jié)果顯示，菌絲侵染擴(kuò)展半徑與活體接種鑒定后RI呈顯著相關(guān)，擴(kuò)展半徑與RI的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.91。由此可見，離體葉片菌絲塊接種方法是穩(wěn)定可靠的。

3 討論

離體葉片接種法，一方面可以大大縮短抗性鑒定周期、提高抗性鑒定的效率，另一方面操作簡單、環(huán)境因素可控，重復(fù)率高；此外，此方法具有不影響篩選材料進(jìn)一步生長的優(yōu)點，抗性材料可以繼續(xù)用于其他用途[9]。所以目前離體葉片接種法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于植物真菌病害如蔓枯病的品種抗性鑒定中[10-11]，但鏈格孢葉斑病菌離體葉片鑒定還未有報道。本研究通過采用室內(nèi)離體葉片和室外苗期接種2種不同的接種方法對20份甜瓜材料進(jìn)行了鏈格孢葉斑病抗性鑒定，研究結(jié)果顯示，離體葉片鑒定結(jié)果與室外苗期活體接種結(jié)果一致，即菌絲侵染擴(kuò)展半徑可用于判斷供試甜瓜材料對鏈格孢葉斑病敏感性。2種方法篩選出相同的5份甜瓜材料具有中等抗性，相關(guān)性達(dá)到0.91(P≤0.05)。因此，本研究建立了一種簡單、有效且容易重復(fù)的甜瓜葉部病害鏈格孢葉斑病鑒定方法。

本研究所采用的20份甜瓜材料均不同程度感染鏈格孢葉斑病，未發(fā)現(xiàn)對鏈格孢葉斑病菌免疫的資源。其中5份材料對鏈格孢葉斑病菌有一定抗病性，根據(jù)RI判斷達(dá)到中抗水平。這5份材料中2份為高代自交系，分別為MM-2(菜瓜高代自交系)，MM-3(新疆甜瓜高代自交系)，另3份材料為新組合。這2個高代自交系可望作為下一步育種親本材料。由于所選材料有限，為發(fā)現(xiàn)更多優(yōu)異抗性資源，需加大種質(zhì)資源數(shù)量，挖掘蘊(yùn)藏潛在有價值的抗性基因資源，用于抗鏈格孢葉斑病菌甜瓜品種的選育和遺傳改良。

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