陸 寬，王雪雅*，孫小靜，霍 昕，高玉瓊，馮發(fā)進，杜成興

（1.貴州省生物技術研究開發(fā)基地，貴州 貴陽 550002；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學院辣椒研究所，貴州 貴陽 550006；3.貴州省科暉制藥廠，貴州 貴陽 550011）

辣椒具有較高的營養(yǎng)價值，富含維生素、礦物質、辣椒素等[1]，有抗菌、抗氧化、控制體重、增加飽腹感等功效[2-4]。據(jù)統(tǒng)計，2016年貴州省辣椒種植面積已達500萬 畝，約占中國的20%，貴州名優(yōu)辣椒品種較多，香辣適宜，具有很好的加工適性。由于辣椒采摘期短，大量鮮椒集中上市，可通過干制及發(fā)酵方式解決貯運困難的問題。目前加工的農(nóng)產(chǎn)品有干辣椒、剁椒、發(fā)酵辣椒等。發(fā)酵辣椒因其能保持鮮椒口感，味道醇厚，又耐貯藏，是消費者常用調(diào)味品之一。由于不同辣椒品種發(fā)酵后的風味具有一定差異性，因此香味是評定發(fā)酵辣椒品質的重要指標之一。

固相微萃取-氣相色譜-質譜（solid phase microextraction-gas chromatography-mass，SPME-GCMS）聯(lián)用、電子鼻均是食品風味成分的研究方法。SPME-GC-MS能對食品含有的揮發(fā)性成分的種類定性。電子鼻則是利用氣體傳感器陣列的響應圖案來識別氣味的電子系統(tǒng)，能快速識別簡單和復雜的揮發(fā)性成分[5]。目前電子鼻技術集中用于茶葉[6]、農(nóng)產(chǎn)品[7-8]、調(diào)味料[9-11]等品種鑒別，食品[12-13]、藥品造假摻假[14-15]等方面，是一種用途廣泛、快速無損的風味物質分析檢測方法。

目前針對辣椒發(fā)酵后揮發(fā)性成分分析的研究較多[16-18]，辣椒經(jīng)發(fā)酵后主要揮發(fā)性成分分為醇類、酯類、酸類、雜環(huán)類、酚類以及酮類6 種，多采用GC-MS對其揮發(fā)性成分進行研究，研究方向多集中在發(fā)酵條件、發(fā)酵工藝以及發(fā)酵菌種等不同處理方法對揮發(fā)性成分的影響，但針對貴州不同辣椒品種發(fā)酵后產(chǎn)品間風味物質差異的相關研究尚不深入。因此，本實驗選取貴州5 個名優(yōu)產(chǎn)地的辣椒品種：黃平線椒、施秉線椒、大方皺椒、百宜平面椒、花溪黨武辣椒，采用SPME-GC-MS及電子鼻技術相結合的方式，對5 個辣椒品種制成的發(fā)酵辣椒進行風味檢測，通過主成分分析（principal component analysis，PCA）及線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）探索5 種發(fā)酵辣椒風味成分的差異，旨在為發(fā)酵辣椒產(chǎn)地及品種初步建立一個快速鑒別體系，保護當?shù)孛褡迤放萍跋M者利益提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取貴州省黃平線椒、施秉線椒、大方皺椒、百宜平面椒、花溪黨武辣椒共5 個品種，均采自當?shù)剞r(nóng)戶。

1.2 儀器與設備

BSA224S-CW電子天平 美國賽多利斯科學儀器公司；PEN3型便攜式電子鼻傳感器 德國Airsense公司；HP6890/5975C GC-MS聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；手動SPME裝置、2cm-50/30 μm二乙基苯（divinylbenzene，DVB）萃取纖維頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

將鮮辣椒去果柄洗凈瀝干后，粗破碎后用膠體磨將辣椒研磨成醬狀，加入質量分數(shù)為8%食鹽，攪拌均勻后裝入發(fā)酵壇中，5 kg/壇，30 ℃發(fā)酵30 d，獲得5 個品種發(fā)酵完成的發(fā)酵辣椒樣品。

1.3.2 電子鼻傳感器檢測

PEN3型電子鼻傳感器由10 種金屬氧化物半導體型化學傳感元件組成，不同傳感器的性能描述如表1所示。準確量取1 g不同品種的發(fā)酵辣椒，放入樣品瓶，靜置10 min后，插入電子鼻探頭吸取頂端空氣，測定揮發(fā)性物質。電子鼻的設置參數(shù)為：樣品間隔時間1 s，清洗時間60 s，歸零時間10 s，樣品準備時間5 s，測定時間80 s，載氣流速200 mL/min，進樣流量200 mL/min。傳感信號在65 s后基本穩(wěn)定，選定采集信號時間為68 s，連續(xù)測定8 次，利用電子鼻自帶的Win Muster軟件對數(shù)據(jù)進行PCA及LDA。

表1 電子鼻傳感器名稱與其響應物質[19]Table1 Electronic nose sensors and their response to odorant compounds

1.3.3 發(fā)酵辣椒風味物質分析

在文獻[17]基礎上進行適當優(yōu)化，具體實驗條件如下：

頂空SPME條件：準確稱取2.5 g樣品于SPME儀采樣瓶中，旋緊瓶蓋，插入裝有2 cm-50/30 μm DVB纖維頭的手動進樣器，在50 ℃左右頂空萃取30 min取出，快速移出萃取頭并立即插入GC儀進樣口（溫度250 ℃）中，熱解吸3min進樣。

GC條件：色譜柱為HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：柱溫45 ℃，保留2 min，以4 ℃/min升溫至230 ℃，保持2 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He（99.999%）；柱前壓7.62 psi，載氣流量1.0 mL/min；不分流進樣；溶劑延遲時間2.0 min。

MS條件：電子電離源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1 125 V；接口溫度280 ℃；質量掃描范圍20～450 u，檢索圖庫為NIST 2011。GC-MS測定結果通過NIST 2011圖庫檢索，并用峰面積歸一法測算各化學成分的相對含量。

2 結果與分析

2.1 貴州不同辣椒品種發(fā)酵后揮發(fā)性風味區(qū)分度分析

2.1.1 貴州不同辣椒品種發(fā)酵后PCA

PCA是考察多個變量間相關性一種多元統(tǒng)計方法，通過電子鼻傳感器對樣品進行數(shù)據(jù)采集，并將所獲取的多指標信息進行轉換和降維，得出貢獻率最大和最主要的因子，利用PCA空間分布圖最大程度上體現(xiàn)樣品間的差異[20]。一般認為，在PCA空間分布圖中數(shù)值距離原點越遠，則其貢獻率越大，主成分能夠更好地反映指標信息[21]。

從圖1可以看出，第1主成分貢獻率為98.85%，第2主成分貢獻率為1.08%，貢獻率總和為99.93%，大于95%，干擾較小[22]，說明PCA方法適用于不同辣椒品種發(fā)酵后樣品揮發(fā)性成分分析，且這2 個主成分可以代表樣品揮發(fā)性風味的主要特征。每組樣品測定數(shù)據(jù)均能成團，說明電子鼻數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和重復性較好。通過比較各組橢圓的橫縱坐標發(fā)現(xiàn)，施秉線椒和百宜平面椒分別與大方皺椒和花溪黨武辣椒發(fā)酵后第1、2主成分差異不大，說明施秉線椒和大方皺椒、百宜平面椒和花溪黨武辣椒發(fā)酵后的風味較為接近，而黃平線椒與其他4 種發(fā)酵辣椒第1、2主成分差異較為明顯，說明黃平線椒發(fā)酵后的風味與其他4 種辣椒發(fā)酵后風味差別較明顯。

圖1 不同辣椒品種發(fā)酵后揮發(fā)性成分PCA圖Fig. 1 Principal component analysis of volatile components of fermented pepper from different varieties

2.1.2 貴州不同辣椒品種發(fā)酵后LDA

LDA是用于判斷樣品所屬類型的一種統(tǒng)計分析方法[23]，與PCA相比，能夠進一步對電子鼻傳感器收集到的信號進行分析，通過擴大不同類別之間數(shù)據(jù)點的距離，縮小同一類別的數(shù)據(jù)點的距離來獲得更精確的分類[24]，從而更好地揭示樣品之間風味物質的差異情況[25]。

圖2 不同辣椒品種發(fā)酵后揮發(fā)性成分LDA圖Fig. 2 Linear discriminant analysis of volatile components of fermented pepper from different varieties

從圖2可以看出，第1主成分和第2主成分的貢獻率分別為91.68%和7.51%，總貢獻率為99.19%。從橢圓的分布來看，5 種樣品互不重疊，區(qū)別明顯，說明LDA能夠很好地區(qū)分不同品種辣椒發(fā)酵后樣品的揮發(fā)性風味。從橢圓間的距離看，施秉線椒和百宜平面椒分別與大方皺椒和花溪黨武辣椒發(fā)酵后所代表的橢圓形距離較近，說明施秉線椒與大方皺椒、百宜平面椒與花溪黨武辣椒發(fā)酵后揮發(fā)性成分差異較小，而黃平線椒與其他4 種發(fā)酵辣椒所代表的橢圓形距離較遠，說明黃平線椒發(fā)酵后揮發(fā)性成分較其他4 組較大。LDA與PCA結果相符。因此，可以采用電子鼻技術對貴州5 種不同辣椒品種發(fā)酵后樣品進行區(qū)分。

2.2 貴州不同品種辣椒發(fā)酵后揮發(fā)性風味物質種類

表2 不同辣椒品種發(fā)酵后揮發(fā)性風味物質種類及相對含量Table2 Relative contents of volatile compound classes in fermented pepper from different varieties

經(jīng)SPME-GC-MS分離和鑒定，結果經(jīng)檢索圖庫和相關資料數(shù)據(jù)核實，結果見表2。5 種不同發(fā)酵辣椒揮發(fā)性風味物質種類共鑒定出124 種成分，其中57 種揮發(fā)性物質為5 種發(fā)酵辣椒共有。黃平線椒、施秉線椒、大方皺椒以及花溪黨武辣椒發(fā)酵后揮發(fā)性成分均以醇類、烴類以及酯類所占比例較大且種類較多，而百宜平面椒發(fā)酵后揮發(fā)性成分則以醇類、酸類以及烴類所占比例較大。其中，黃平線椒發(fā)酵后揮發(fā)性成分共鑒定出97 種，以酯類相對含量最高，為36.82%；施秉線椒和大方皺椒發(fā)酵后鑒定出的揮發(fā)性成分分別為88、94 種，均以醇類相對含量最高，分別為31.88%、28.99%，百宜平面椒和花溪黨武辣椒發(fā)酵后鑒定出的揮發(fā)性成分分別為89、71 種，均以烴類相對含量最高，分別為26.75%、35.08%。說明5 種發(fā)酵辣椒揮發(fā)性物質具有一定的差異性，其中黃平線椒與其余4 種發(fā)酵辣椒揮發(fā)性成分差別較大，而施秉線椒和大方皺椒、百宜平面椒和花溪黨武辣椒發(fā)酵后主要揮發(fā)性成分相似，這與電子鼻PCA和LDA結果相符。

2.3 貴州不同辣椒品種發(fā)酵后香氣特征分析

貴州不同辣椒品種發(fā)酵后揮發(fā)性風味化合物的種類和相對含量結果如表3所示。

表3 不同辣椒品種發(fā)酵后揮發(fā)性風味物質及相對含量Table3 Volatile composition of fermented pepper from different varieties

續(xù)表3

續(xù)表3

續(xù)表3

2.3.1 醇類物質

大部分醇類物質的感知閾值較高，對發(fā)酵辣椒風味貢獻較小，只有少數(shù)不飽和醇類物質的感知閾值較低，對發(fā)酵辣椒風味貢獻較大，如萜醇類物質多以青果、花香以及蜜香香氣為主[26]，賦予辣椒發(fā)酵制品特殊的香氣特征。5 種發(fā)酵辣椒揮發(fā)性成分中醇類物質均含有乙醇、芳樟醇、牻牛兒醇、d-橙花叔醇等。其中施秉線椒發(fā)酵后乙醇相對含量較其余4 組高，為18.617%，其賦予發(fā)酵辣椒特殊的酒香氣味。百宜平面椒中芳樟醇相對含量最高，為3.642%，其賦予其木香、柑橘香、花香等氣味。大方皺椒中牻牛兒醇和d-橙花叔醇相對含量最高，分別為2.983%、0.408%，牻牛兒醇和β-香茅醇共同賦予其甜玫瑰花香，其中β-香茅醇又賦予其蘋果以及橙花的香氣[27]，牻牛兒醇又稱香葉醇，具有抗菌、驅蟲作用，廣泛用于藥品、煙草、食品配料領域[28]。

2.3.2 烴類物質

烷烴類物質一般香氣較弱或無氣味[29]，因此不作為發(fā)酵辣椒呈香物質。而烯烴類物質閾值較低，且是辣椒風味物質中種類最多、含量相對較高的一類化合物，對辣椒的風味起著重要作用。5 種發(fā)酵辣椒揮發(fā)性成分中均含有α-姜烯、β-倍半水芹烯、（E,E）-α-金合歡烯、β-甜沒藥烯等成分?；ㄏh武辣椒發(fā)酵后α-姜烯和β-倍半水芹烯相對含量高于其他4 種發(fā)酵辣椒，分別為13.104%和4.925%。其中，α-姜烯為姜類物質的主要揮發(fā)性成分，提供特殊的姜香氣味，且據(jù)報道姜烯可能具有抑菌作用[30]。而倍半萜烯類的含氧衍生物大多具有較強的香氣和生物活性，是醫(yī)藥、食品、香料和化妝品工業(yè)的重要原料[31-32]。在百宜平面椒發(fā)酵后揮發(fā)性成分中檢測出能夠提供柑橘香味的α-松油烯，相對含量為0.410%，而在其余4 種發(fā)酵辣椒樣品中未檢測出?；ㄏh武辣椒發(fā)酵后檢測出其余4 種發(fā)酵辣椒樣品不含有的（E）-石竹烯，為發(fā)酵后樣品提供辛香、木香、柑橘香、樟腦香以及溫和的丁香香氣。

2.3.3 酯類物質

酯化反應是辣椒發(fā)酵過程中主要的反應之一[33]，且酯類物質也是5 種發(fā)酵辣椒中相對含量較高、種類相對較多的物質，因此酯類是構成發(fā)酵辣椒特殊風味的重要物質。低分子質量的酯類化合物香氣濃郁，一般具有芳香氣和特定的水果香氣[34]。黃平線椒發(fā)酵樣品中棕櫚酸乙酯相對含量較其余4 種發(fā)酵辣椒高，占其總揮發(fā)性成分的11.422%，此物質也曾在其他果實中發(fā)現(xiàn)[35-36]。其他相對含量較多的酯類揮發(fā)物有乙酸乙酯、乙酸香葉酯、亞油酸乙酯以及油酸乙酯，賦予了發(fā)酵辣椒一定的保健性。乙酸香葉酯具有玫瑰和薰衣草香氣，發(fā)酵后的花溪黨武辣椒相對其余4 個發(fā)酵辣椒品種乙酸香葉酯相對含量較高，為1.670%，隨后依次為施秉線椒（1.518%）、黃平線椒（1.481%）、大方皺椒（1.040%）以及百宜平面椒（0.707%）。水楊酸甲酯僅在施秉線椒發(fā)酵樣品中檢出，具有冬青葉香味，常用于蘭花、康乃馨、三葉草等香精的調(diào)和，可用于食品中，也用于醫(yī)藥上。

2.3.4 醛、酮、酸類物質

醛、酮、酸類化合物在5 種發(fā)酵辣椒樣品揮發(fā)性成分中所占比例雖然較低，但是因其閾值不同，對辣椒發(fā)酵后的風味同樣起到重要作用。醛類物質香氣濃烈，多為花香及果香氣味。大方皺椒中檢測到的E-檸檬醛，相對含量為0.582%，有能夠使人感到愉悅的檸檬氣息，是抗氧化劑有效穩(wěn)定劑[37]，而其余4 種發(fā)酵辣椒中并未檢測出該物質。酮類物質性質穩(wěn)定，并且香氣持久，一般具有花香氣味。L-樟腦具有清香氣味，在5 種發(fā)酵辣椒樣品中均被檢測到。其中百宜平面椒中L-樟腦相對含量最高，為0.438%。5 個發(fā)酵辣椒樣品中，百宜平面椒發(fā)酵后酸類物質相對含量較高，占總揮發(fā)性成分的22.31%，其中乙酸占總揮發(fā)性成分的20.364%，這可能是由于百宜平面椒相對其余4 個品種更利于微生物發(fā)酵，產(chǎn)酸量較大；而豆蔻酸僅在黃平線椒發(fā)酵樣品中被檢測到，其相對含量為0.081%。

2.3.5 其他物質

除萜醇和烯烴類物質外，還有一些對發(fā)酵辣椒貢獻比較大的成分。如樣品中檢測到的含硫化合物，是一類容易辨識的特殊香味，具有豐富蔬菜風味的作用，多為大蒜、洋蔥等食物的代表性物質，與其他揮發(fā)性物質混合協(xié)調(diào)后，形成了辣椒發(fā)酵后獨特的風味。辣椒發(fā)酵后檢測出含硫化合物有7 種，百宜平面椒發(fā)酵后含硫化合物占總揮發(fā)性成分比例較高（14.53%），其次是發(fā)酵后的施秉線椒（13.13%），黃平線椒發(fā)酵后含硫化合物相對含量較低（3.04%）。甲基烯丙基二硫化物、二烯丙基二硫化物、雙烯丙基化三硫、硫化薄荷這4 種硫化物均在5 種發(fā)酵樣品中檢出。其中雙烯丙基三硫醚又稱大蒜素，是一種生物活性物質，有護肝、抗菌等作用[38-39]。

3 結 論

通過SPME-GC-MS對貴州不同辣椒品種發(fā)酵后揮發(fā)性成分進行分析檢測，除百宜平面椒以醇類、酸類以及烴類物質為主要揮發(fā)性成分外，其余4 種不同辣椒品種發(fā)酵后揮發(fā)性成分主要為醇類、烴類和酯類。其中黃平線椒以酯類物質所占比例最高，施秉線椒和大方皺椒以醇類物質所占比例最高，百宜平面椒和花溪黨武辣椒以烴類物質所占比例最高。烯烴類和萜醇類物質為新鮮辣椒的主要呈香物質，同樣是辣椒發(fā)酵后的主要香氣成分，賦予了發(fā)酵辣椒獨特的花香、果香等香氣特征。而在辣椒發(fā)酵過程中，經(jīng)過有關物質反應后使得酯類物質增加，同樣起到呈香的作用。黃平線椒的香氣構成不僅種類多，而且與其余4 種發(fā)酵辣椒樣品差別較大，這一結果符合電子鼻PCA和LDA的結果，但是其余4 種發(fā)酵辣椒經(jīng)過PCA后，分離效果不是很好。而通過LDA的進一步分析，可以使5 種發(fā)酵辣椒完全區(qū)分，證明利用電子鼻，通過LDA能夠很好地區(qū)分5 個不同品種辣椒發(fā)酵后樣品的揮發(fā)性成分。

本研究通過SPME-GC-MS分析系統(tǒng)初步確定5 個辣椒品種制成發(fā)酵辣椒的風味成分種類及相對比例，結合電子鼻技術對其進行有效區(qū)分，這將為不同產(chǎn)地名優(yōu)發(fā)酵辣椒的鑒別、合理加工及質量控制提供參考。

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