余運西

這種新方法能將肝癌的漏診率降低一半以上，幫助醫(yī)生發(fā)現更多的早期肝癌患者。

近日，國際頂尖學術雜志《Nature Materials》上一篇關于肝癌早診早治的文章一經發(fā)表，即引起國內外科學界的廣泛關注。中山大學腫瘤防治中心主任徐瑞華教授，與美國加州大學圣迭戈分校的張康教授，一同帶領中美科學家團隊，經反復探求，終于破解了一項眾多科學家想攻克的世界性難題——通過檢測少量血液中循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）特定位點甲基化水平，對肝癌進行早期診斷及療效和預后預測的新方法。

記者了解到，這種新方法與原來常規(guī)的甲胎蛋白檢測相比，將肝癌的漏診率降低一半以上，能幫助醫(yī)生發(fā)現更多的早期肝癌患者。

《Nature Materials》是一本對論文要求近于苛刻的學術刊物，每年發(fā)表論文僅170篇左右，影響因子高達39.737。所選擇的審稿人也是相關研究領域的權威或著名學者，以嚴謹細致著稱。審稿專家給出了這樣的總結：“（該研究意味著）腫瘤的液體活檢技術將迎來一個全新的時代”。

100位肝癌患者中有40位漏診

肝癌被稱為癌中之王。2015年的統計資料表明，全世界每年肝癌新發(fā)和死亡病例分別為78.3萬和74.6萬。其中，我國肝癌新發(fā)病例和死亡病例分別高達46.6萬和42.2萬，分別居所有惡性腫瘤第四和第三位，均占世界肝癌新發(fā)病例和死亡病例的50%以上，造成的生命損失和公共衛(wèi)生負擔可謂觸目驚心。

徐瑞華教授介紹說，肝癌起病隱匿，患者一旦出現臨床癥狀，病情往往已經處于中晚期，失去了根治性治療的機會，預后極其兇險。早期肝癌5年生存率為50%～70%，中期5年生存率為25%～30%，晚期5年生存率為10%～15%，末期5年生存率為0%。“也就是說，整體5年生存率是仍不足15%。而早期獲得診斷的肝癌患者，在經過有效治療后，5年生存率可達到50%以上。”

現有的肝癌標志物甲胎蛋白AFP雖然在部分患者血液中可檢測到明顯的升高（超過20ng/ml），但其敏感性只有60%左右。這就意味著，如果僅依賴AFP作為早期診斷標志物，100位肝癌患者中將有40位漏診。

在臨床上目睹太多中晚期肝癌患者家庭痛失親人的悲劇，徐瑞華教授團隊一直都在血液中尋找合適的肝癌早期診斷標志物。在經過無數個日夜艱苦的探求之后，2017年10月，徐瑞華教授與張康教授帶領的中美科學家團隊，終于研究出通過檢測少量血液中ctDNA特定位點甲基化水平，對肝癌進行早期診斷及療效和預后預測的新方法。

肝癌“身份指紋”被科學家破獲

徐瑞華教授形象地說，ctDNA相當于腫瘤細胞釋放到血液中的“身份指紋”，由于其攜帶有與原發(fā)腫瘤相一致的甲基化改變，理論上可以利用ctDNA的甲基化譜對腫瘤進行診斷。這一被稱為液體活檢的新技術已經成為當前腫瘤研究領域的熱點之一。但是，ctDNA在血液中的含量極微小，每毫升血中僅有約20ng，相當于一滴水的一億分之一，并且混雜在更大量的正常游離DNA背景中。在這么微量的ctDNA中檢測單個堿基的甲基化水平，好比在機場和火車站的數百萬人流中找到個別犯罪分子，其難度可想而知。

經過艱苦的探索，研究團隊先后攻克了穩(wěn)定提取微量ctDNA、提高重亞硫酸鹽轉化效率、靶向甲基化PCR擴增及測序、海量數據的統計學分析處理等一個個技術壁壘，終于從40多萬個候選位點中，分別尋找到10個早期診斷和療效相關以及8個預后相關的位點。這就像是破獲了肝癌的“身份指紋”，讓即使是很早期的肝癌病灶也無所遁形。

可喜的是，這10個早期診斷位點的甲基化水平在總共1098例肝癌患者和835例健康人的研究人群中，顯示出高達84.8%的診斷敏感性和93.1%的特異性，還能準確地預測腫瘤的分期、療效和復發(fā)。

徐瑞華教授分析說，這意味著利用這一方法，肝癌患者的漏診率將比AFP降低一半以上，早期肝癌患者及時確診以后，將更有機會接受根治性治療，其預后將得到極大的改善。而利用8個預后相關位點的甲基化水平，能準確預測不同患者的生存和預后，有利于指導醫(yī)生對不同患者進行更為個體化的精準治療。例如對預后不佳者，應避免給予過度治療，而對復發(fā)高?；颊撸瑒t給予更為積極的輔助治療等。

抽取幾毫升血液即可完成檢測

這一新方法與傳統的肝癌診斷技術相比具有明顯的優(yōu)越性。

首先是簡便快速。僅需抽取幾毫升血液即可完成檢測，患者可避免活檢創(chuàng)傷和放射性輻射。

其次是診斷敏感性和特異性更高，誤診和漏診率大大降低。單純依靠AFP檢測，只能發(fā)現60%左右真正的肝癌患者；AFP對肝癌的診斷特異性在80%左右，也就是說其對肝癌的誤診率為20%。而甲基化標志物對肝癌的診斷敏感性為84.9%，特異性為93.1%。這意味著，新方法的漏診率降至15%左右，而誤診率更是降至7%左右。

再次，可以實時監(jiān)測腫瘤的療效，并早于常規(guī)影像學檢查數周乃至數月發(fā)現腫瘤的復發(fā)。

最后是經濟性，尤其是在大規(guī)模肝癌篩查中的應用，能夠節(jié)約大量寶貴的醫(yī)療資源。

利于開展肝癌個體化精準治療

目前，肝癌ctDNA甲基化診斷試劑盒的研發(fā)已經取得實質性進展，已于10月中旬首先在中山大學腫瘤防治中心應用，預計很快就能夠大規(guī)模生產，年供應100萬人份的試劑盒。檢測對象重點是具有肝癌高危因素，如既往有肝炎肝硬化病史、肝癌家族史，或既往罹患肝癌接受了手術等治療的人群，進一步會推廣到進行常規(guī)防癌體檢的人群。

這一成果的進一步轉化推廣，將極大提高肝癌早期診斷的準確率，并有利于開展更為個體化的精準治療，對于提高肝癌患者的整體療效具有重大意義。endprint

徐瑞華教授表示，他的團隊將繼續(xù)研究ctDNA甲基化標志物在結直腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等其他嚴重威脅人們健康的常見腫瘤中的應用，力求為這些腫瘤的篩查、診斷、療效監(jiān)測與預后預測提供新的有效手段，造福更多腫瘤患者。

Q&A

問：為什么ctDNA的甲基化更適宜作為早期診斷和預后預測的標志物，而非基因突變？

答：有這么幾個原因。首先大多數腫瘤缺乏明顯的驅動基因突變。從美國的腫瘤基因圖譜計劃（TCGA）可以看出，腫瘤患者的基因突變非常個體化，而罹患同一腫瘤的不同患者，其DNA的甲基化改變相對穩(wěn)定和一致。

其次，ctDNA在血液中含量很低，對于突變頻率較低的基因位點，需要極深的測序深度才能檢測到，成本高昂。而在200bp～300bp左右的ctDNA片段中，可存在多個可能發(fā)生甲基化改變的CpG位點，相對低頻率的基因突變更容易檢出。

最后，ctDNA甲基化變化往往發(fā)生在體細胞基因突變之前，是腫瘤發(fā)生的早期分子事件，因此更利于早期診斷。

問：科學家們?yōu)槭裁匆x擇甲基化來診斷早期肝癌？是基于哪些特征？

答：DNA甲基化是一種表觀遺傳的修飾，是指不需要改變核苷酸序列的基因表達可遺傳改變。其特征是可逆性、可遺傳性，以及DNA的序列未發(fā)生改變。異常的DNA甲基化會導致基因的表達異常，從而促進癌癥的發(fā)生。DNA甲基化是腫瘤發(fā)生中的早期事件，早于基因突變從而更有利于早期診斷。

此外，甲基化特異的PCR 技術的出現，使得DNA甲基化水平的檢測變得十分方便。DNA甲基化檢測穩(wěn)定性好，有組織特異性，易于檢測且其異常程度常與癌癥的進展相關。因此，我們選擇了它。

問：目前靶向治療已經成為肝癌治療方向之一，下一步有無可能通過檢測ctDNA中的特定位點甲基化水平，預測患者對靶向藥物的療效？

答：這是我們下一步的研究計劃之一，但目前臨床上接受靶向治療的肝癌患者還不是很多，ctDNA甲基化標志物的篩選需要一定數量的受試者樣本，才有可能通過統計學分析發(fā)現具有療效預測價值的甲基化位點。我們已經開始著手收集這一類患者的標本，希望能在積累到一定數量以后，尋找到這樣的甲基化標志物。此外，由于與基因的突變不同，表觀遺傳學的改變大都是可逆的。因此，利用藥物來改變細胞DNA的甲基化改變本身就可能成為治療肝癌的一條新途徑。

問：目前是否已有病人通過你們的方法發(fā)現肝癌？

答：我們的正常對照是收取進行健康體檢的人群的標本，我們前后檢測了大約5000例人群的標本，其中有4例～5例是明顯增高的，然后追蹤患者情況，最后明確診斷為肝癌。另有10多例在可疑范圍內，正在密切隨訪當中。這也是我們下一步要做的工作，即進行前瞻性的大規(guī)模篩查研究，希望能通過我們的新方法，進一步提高篩查的效價比，同時減少篩查成本，節(jié)約醫(yī)療資源。

問：既然這是一項國際國內眾多科學家都想攻克的世界性難題，那么您的研究取得成功的關鍵因素有哪些呢？

答：首先是我們堅持以科學問題為導向，密切結合臨床實踐需要和我國國情，著眼于國際最新研究方向，找到了這么一個尖端的研究思路。其次是我們掌握了一系列關鍵性的實驗技術。再次，作為華南地區(qū)最大、最頂尖的腫瘤中心，我們具有豐富的肝癌病例來源，而科學完善的隨訪制度和信息系統，能保證患者的臨床資料和生存隨訪數據真實可信。最后，我們擁有一個跨學科、跨國界的研究團隊，包括臨床醫(yī)生、基礎醫(yī)學研究人員、生物信息學專家等，為我們的研究取得突破打下了堅實的基礎。

鏈接：現有的肝癌診斷和篩查方法

原發(fā)性肝癌診斷

原發(fā)性肝癌病理學診斷標準：

肝臟占位病灶或者肝外轉移灶活檢或手術切除組織標本，經病理組織學和/或細胞學檢查診斷為HCC，此為金標準。

原發(fā)性肝癌臨床診斷標準：

1.具有肝硬化以及HBV和/或HCV感染的證據。

2.血清AFP≥400μg/L持續(xù)1個月或≥200μg/L持續(xù)2個月，并能排除其他原因引起的AFP升高。

3.典型的HCC影像學特征：同期多排CT掃描和/或動態(tài)對比增強MRI檢查顯示肝臟占位在動脈期快速不均質血管強化，而靜脈期或延遲期快速洗脫。

1）如果肝臟占位直徑為1cm～2cm，則需要CT和MRI兩項影像學檢查都顯示肝臟占位具有上述肝癌的特征，方可診斷。

2）如果肝臟占位直徑≥2cm，CT和MRI兩項影像學檢查中有一項顯示肝臟占位具有上述肝癌的特征，即可診斷。

原發(fā)性肝癌的篩查

常規(guī)監(jiān)測篩查指標主要包括AFP和肝臟超聲檢查（US）。

對于≥40歲的男性或≥50歲女性，具有HBV和/或HCV感染，嗜酒、合并糖尿病以及有肝癌家族史的高危人群，一般是每隔6個月進行一次檢查。由于AFP的敏感性和特異度不高，2010版美國肝病研究學會指南已不再將AFP作為篩查指標，超聲檢查對于大于20mm的結節(jié)，診斷符合率為84%，而對于肝內5mm～20mm的結節(jié)，超聲的敏感性只有33%。endprint