余運(yùn)西

這種新方法能將肝癌的漏診率降低一半以上，幫助醫(yī)生發(fā)現(xiàn)更多的早期肝癌患者。

近日，國(guó)際頂尖學(xué)術(shù)雜志《Nature Materials》上一篇關(guān)于肝癌早診早治的文章一經(jīng)發(fā)表，即引起國(guó)內(nèi)外科學(xué)界的廣泛關(guān)注。中山大學(xué)腫瘤防治中心主任徐瑞華教授，與美國(guó)加州大學(xué)圣迭戈分校的張康教授，一同帶領(lǐng)中美科學(xué)家團(tuán)隊(duì)，經(jīng)反復(fù)探求，終于破解了一項(xiàng)眾多科學(xué)家想攻克的世界性難題——通過檢測(cè)少量血液中循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）特定位點(diǎn)甲基化水平，對(duì)肝癌進(jìn)行早期診斷及療效和預(yù)后預(yù)測(cè)的新方法。

記者了解到，這種新方法與原來(lái)常規(guī)的甲胎蛋白檢測(cè)相比，將肝癌的漏診率降低一半以上，能幫助醫(yī)生發(fā)現(xiàn)更多的早期肝癌患者。

《Nature Materials》是一本對(duì)論文要求近于苛刻的學(xué)術(shù)刊物，每年發(fā)表論文僅170篇左右，影響因子高達(dá)39.737。所選擇的審稿人也是相關(guān)研究領(lǐng)域的權(quán)威或著名學(xué)者，以嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致著稱。審稿專家給出了這樣的總結(jié)：“（該研究意味著）腫瘤的液體活檢技術(shù)將迎來(lái)一個(gè)全新的時(shí)代”。

100位肝癌患者中有40位漏診

肝癌被稱為癌中之王。2015年的統(tǒng)計(jì)資料表明，全世界每年肝癌新發(fā)和死亡病例分別為78.3萬(wàn)和74.6萬(wàn)。其中，我國(guó)肝癌新發(fā)病例和死亡病例分別高達(dá)46.6萬(wàn)和42.2萬(wàn)，分別居所有惡性腫瘤第四和第三位，均占世界肝癌新發(fā)病例和死亡病例的50%以上，造成的生命損失和公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)可謂觸目驚心。

徐瑞華教授介紹說，肝癌起病隱匿，患者一旦出現(xiàn)臨床癥狀，病情往往已經(jīng)處于中晚期，失去了根治性治療的機(jī)會(huì)，預(yù)后極其兇險(xiǎn)。早期肝癌5年生存率為50%～70%，中期5年生存率為25%～30%，晚期5年生存率為10%～15%，末期5年生存率為0%?！耙簿褪钦f，整體5年生存率是仍不足15%。而早期獲得診斷的肝癌患者，在經(jīng)過有效治療后，5年生存率可達(dá)到50%以上?！?/p>

現(xiàn)有的肝癌標(biāo)志物甲胎蛋白AFP雖然在部分患者血液中可檢測(cè)到明顯的升高（超過20ng/ml），但其敏感性只有60%左右。這就意味著，如果僅依賴AFP作為早期診斷標(biāo)志物，100位肝癌患者中將有40位漏診。

在臨床上目睹太多中晚期肝癌患者家庭痛失親人的悲劇，徐瑞華教授團(tuán)隊(duì)一直都在血液中尋找合適的肝癌早期診斷標(biāo)志物。在經(jīng)過無(wú)數(shù)個(gè)日夜艱苦的探求之后，2017年10月，徐瑞華教授與張康教授帶領(lǐng)的中美科學(xué)家團(tuán)隊(duì)，終于研究出通過檢測(cè)少量血液中ctDNA特定位點(diǎn)甲基化水平，對(duì)肝癌進(jìn)行早期診斷及療效和預(yù)后預(yù)測(cè)的新方法。

肝癌“身份指紋”被科學(xué)家破獲

徐瑞華教授形象地說，ctDNA相當(dāng)于腫瘤細(xì)胞釋放到血液中的“身份指紋”，由于其攜帶有與原發(fā)腫瘤相一致的甲基化改變，理論上可以利用ctDNA的甲基化譜對(duì)腫瘤進(jìn)行診斷。這一被稱為液體活檢的新技術(shù)已經(jīng)成為當(dāng)前腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。但是，ctDNA在血液中的含量極微小，每毫升血中僅有約20ng，相當(dāng)于一滴水的一億分之一，并且混雜在更大量的正常游離DNA背景中。在這么微量的ctDNA中檢測(cè)單個(gè)堿基的甲基化水平，好比在機(jī)場(chǎng)和火車站的數(shù)百萬(wàn)人流中找到個(gè)別犯罪分子，其難度可想而知。

經(jīng)過艱苦的探索，研究團(tuán)隊(duì)先后攻克了穩(wěn)定提取微量ctDNA、提高重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率、靶向甲基化PCR擴(kuò)增及測(cè)序、海量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理等一個(gè)個(gè)技術(shù)壁壘，終于從40多萬(wàn)個(gè)候選位點(diǎn)中，分別尋找到10個(gè)早期診斷和療效相關(guān)以及8個(gè)預(yù)后相關(guān)的位點(diǎn)。這就像是破獲了肝癌的“身份指紋”，讓即使是很早期的肝癌病灶也無(wú)所遁形。

可喜的是，這10個(gè)早期診斷位點(diǎn)的甲基化水平在總共1098例肝癌患者和835例健康人的研究人群中，顯示出高達(dá)84.8%的診斷敏感性和93.1%的特異性，還能準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)腫瘤的分期、療效和復(fù)發(fā)。

徐瑞華教授分析說，這意味著利用這一方法，肝癌患者的漏診率將比AFP降低一半以上，早期肝癌患者及時(shí)確診以后，將更有機(jī)會(huì)接受根治性治療，其預(yù)后將得到極大的改善。而利用8個(gè)預(yù)后相關(guān)位點(diǎn)的甲基化水平，能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)不同患者的生存和預(yù)后，有利于指導(dǎo)醫(yī)生對(duì)不同患者進(jìn)行更為個(gè)體化的精準(zhǔn)治療。例如對(duì)預(yù)后不佳者，應(yīng)避免給予過度治療，而對(duì)復(fù)發(fā)高?；颊?，則給予更為積極的輔助治療等。

抽取幾毫升血液即可完成檢測(cè)

這一新方法與傳統(tǒng)的肝癌診斷技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)越性。

首先是簡(jiǎn)便快速。僅需抽取幾毫升血液即可完成檢測(cè)，患者可避免活檢創(chuàng)傷和放射性輻射。

其次是診斷敏感性和特異性更高，誤診和漏診率大大降低。單純依靠AFP檢測(cè)，只能發(fā)現(xiàn)60%左右真正的肝癌患者；AFP對(duì)肝癌的診斷特異性在80%左右，也就是說其對(duì)肝癌的誤診率為20%。而甲基化標(biāo)志物對(duì)肝癌的診斷敏感性為84.9%，特異性為93.1%。這意味著，新方法的漏診率降至15%左右，而誤診率更是降至7%左右。

再次，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤的療效，并早于常規(guī)影像學(xué)檢查數(shù)周乃至數(shù)月發(fā)現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)。

最后是經(jīng)濟(jì)性，尤其是在大規(guī)模肝癌篩查中的應(yīng)用，能夠節(jié)約大量寶貴的醫(yī)療資源。

利于開展肝癌個(gè)體化精準(zhǔn)治療

目前，肝癌ctDNA甲基化診斷試劑盒的研發(fā)已經(jīng)取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，已于10月中旬首先在中山大學(xué)腫瘤防治中心應(yīng)用，預(yù)計(jì)很快就能夠大規(guī)模生產(chǎn)，年供應(yīng)100萬(wàn)人份的試劑盒。檢測(cè)對(duì)象重點(diǎn)是具有肝癌高危因素，如既往有肝炎肝硬化病史、肝癌家族史，或既往罹患肝癌接受了手術(shù)等治療的人群，進(jìn)一步會(huì)推廣到進(jìn)行常規(guī)防癌體檢的人群。

這一成果的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化推廣，將極大提高肝癌早期診斷的準(zhǔn)確率，并有利于開展更為個(gè)體化的精準(zhǔn)治療，對(duì)于提高肝癌患者的整體療效具有重大意義。endprint

徐瑞華教授表示，他的團(tuán)隊(duì)將繼續(xù)研究ctDNA甲基化標(biāo)志物在結(jié)直腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等其他嚴(yán)重威脅人們健康的常見腫瘤中的應(yīng)用，力求為這些腫瘤的篩查、診斷、療效監(jiān)測(cè)與預(yù)后預(yù)測(cè)提供新的有效手段，造福更多腫瘤患者。

Q&A

問：為什么ctDNA的甲基化更適宜作為早期診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的標(biāo)志物，而非基因突變？

答：有這么幾個(gè)原因。首先大多數(shù)腫瘤缺乏明顯的驅(qū)動(dòng)基因突變。從美國(guó)的腫瘤基因圖譜計(jì)劃（TCGA）可以看出，腫瘤患者的基因突變非常個(gè)體化，而罹患同一腫瘤的不同患者，其DNA的甲基化改變相對(duì)穩(wěn)定和一致。

其次，ctDNA在血液中含量很低，對(duì)于突變頻率較低的基因位點(diǎn)，需要極深的測(cè)序深度才能檢測(cè)到，成本高昂。而在200bp～300bp左右的ctDNA片段中，可存在多個(gè)可能發(fā)生甲基化改變的CpG位點(diǎn)，相對(duì)低頻率的基因突變更容易檢出。

最后，ctDNA甲基化變化往往發(fā)生在體細(xì)胞基因突變之前，是腫瘤發(fā)生的早期分子事件，因此更利于早期診斷。

問：科學(xué)家們?yōu)槭裁匆x擇甲基化來(lái)診斷早期肝癌？是基于哪些特征？

答：DNA甲基化是一種表觀遺傳的修飾，是指不需要改變核苷酸序列的基因表達(dá)可遺傳改變。其特征是可逆性、可遺傳性，以及DNA的序列未發(fā)生改變。異常的DNA甲基化會(huì)導(dǎo)致基因的表達(dá)異常，從而促進(jìn)癌癥的發(fā)生。DNA甲基化是腫瘤發(fā)生中的早期事件，早于基因突變從而更有利于早期診斷。

此外，甲基化特異的PCR 技術(shù)的出現(xiàn)，使得DNA甲基化水平的檢測(cè)變得十分方便。DNA甲基化檢測(cè)穩(wěn)定性好，有組織特異性，易于檢測(cè)且其異常程度常與癌癥的進(jìn)展相關(guān)。因此，我們選擇了它。

問：目前靶向治療已經(jīng)成為肝癌治療方向之一，下一步有無(wú)可能通過檢測(cè)ctDNA中的特定位點(diǎn)甲基化水平，預(yù)測(cè)患者對(duì)靶向藥物的療效？

答：這是我們下一步的研究計(jì)劃之一，但目前臨床上接受靶向治療的肝癌患者還不是很多，ctDNA甲基化標(biāo)志物的篩選需要一定數(shù)量的受試者樣本，才有可能通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)具有療效預(yù)測(cè)價(jià)值的甲基化位點(diǎn)。我們已經(jīng)開始著手收集這一類患者的標(biāo)本，希望能在積累到一定數(shù)量以后，尋找到這樣的甲基化標(biāo)志物。此外，由于與基因的突變不同，表觀遺傳學(xué)的改變大都是可逆的。因此，利用藥物來(lái)改變細(xì)胞DNA的甲基化改變本身就可能成為治療肝癌的一條新途徑。

問：目前是否已有病人通過你們的方法發(fā)現(xiàn)肝癌？

答：我們的正常對(duì)照是收取進(jìn)行健康體檢的人群的標(biāo)本，我們前后檢測(cè)了大約5000例人群的標(biāo)本，其中有4例～5例是明顯增高的，然后追蹤患者情況，最后明確診斷為肝癌。另有10多例在可疑范圍內(nèi)，正在密切隨訪當(dāng)中。這也是我們下一步要做的工作，即進(jìn)行前瞻性的大規(guī)模篩查研究，希望能通過我們的新方法，進(jìn)一步提高篩查的效價(jià)比，同時(shí)減少篩查成本，節(jié)約醫(yī)療資源。

問：既然這是一項(xiàng)國(guó)際國(guó)內(nèi)眾多科學(xué)家都想攻克的世界性難題，那么您的研究取得成功的關(guān)鍵因素有哪些呢？

答：首先是我們堅(jiān)持以科學(xué)問題為導(dǎo)向，密切結(jié)合臨床實(shí)踐需要和我國(guó)國(guó)情，著眼于國(guó)際最新研究方向，找到了這么一個(gè)尖端的研究思路。其次是我們掌握了一系列關(guān)鍵性的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。再次，作為華南地區(qū)最大、最頂尖的腫瘤中心，我們具有豐富的肝癌病例來(lái)源，而科學(xué)完善的隨訪制度和信息系統(tǒng)，能保證患者的臨床資料和生存隨訪數(shù)據(jù)真實(shí)可信。最后，我們擁有一個(gè)跨學(xué)科、跨國(guó)界的研究團(tuán)隊(duì)，包括臨床醫(yī)生、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究人員、生物信息學(xué)專家等，為我們的研究取得突破打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

鏈接：現(xiàn)有的肝癌診斷和篩查方法

原發(fā)性肝癌診斷

原發(fā)性肝癌病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)：

肝臟占位病灶或者肝外轉(zhuǎn)移灶活檢或手術(shù)切除組織標(biāo)本，經(jīng)病理組織學(xué)和/或細(xì)胞學(xué)檢查診斷為HCC，此為金標(biāo)準(zhǔn)。

原發(fā)性肝癌臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)：

1.具有肝硬化以及HBV和/或HCV感染的證據(jù)。

2.血清AFP≥400μg/L持續(xù)1個(gè)月或≥200μg/L持續(xù)2個(gè)月，并能排除其他原因引起的AFP升高。

3.典型的HCC影像學(xué)特征：同期多排CT掃描和/或動(dòng)態(tài)對(duì)比增強(qiáng)MRI檢查顯示肝臟占位在動(dòng)脈期快速不均質(zhì)血管強(qiáng)化，而靜脈期或延遲期快速洗脫。

1）如果肝臟占位直徑為1cm～2cm，則需要CT和MRI兩項(xiàng)影像學(xué)檢查都顯示肝臟占位具有上述肝癌的特征，方可診斷。

2）如果肝臟占位直徑≥2cm，CT和MRI兩項(xiàng)影像學(xué)檢查中有一項(xiàng)顯示肝臟占位具有上述肝癌的特征，即可診斷。

原發(fā)性肝癌的篩查

常規(guī)監(jiān)測(cè)篩查指標(biāo)主要包括AFP和肝臟超聲檢查（US）。

對(duì)于≥40歲的男性或≥50歲女性，具有HBV和/或HCV感染，嗜酒、合并糖尿病以及有肝癌家族史的高危人群，一般是每隔6個(gè)月進(jìn)行一次檢查。由于AFP的敏感性和特異度不高，2010版美國(guó)肝病研究學(xué)會(huì)指南已不再將AFP作為篩查指標(biāo)，超聲檢查對(duì)于大于20mm的結(jié)節(jié)，診斷符合率為84%，而對(duì)于肝內(nèi)5mm～20mm的結(jié)節(jié)，超聲的敏感性只有33%。endprint