林歡歡　劉肇興　吳興等

[摘要]最近十年對(duì)細(xì)胞生物材料的研究已經(jīng)轉(zhuǎn)向三維研究。通過(guò)3D細(xì)胞培養(yǎng)模擬天然細(xì)胞外環(huán)境，水凝膠提供了良好的3D生物材料組織支架。因此，明膠甲基丙烯酰（Gelat in methacryloyl，GelMA）水凝膠最近受到越來(lái)越多的關(guān)注。這主要由明膠的固有生物活性和可光交聯(lián)水凝膠的優(yōu)點(diǎn)。各種研究表明GelMA是一種多功能基質(zhì)，可用于從血管系統(tǒng)到軟骨和骨工程組織的類(lèi)似物。生物支架和生物培養(yǎng)方法的結(jié)合對(duì)于證明細(xì)胞功能或構(gòu)建形狀保持至再生組織的發(fā)展是很必要的。GelMA在該過(guò)程中具有關(guān)鍵的指導(dǎo)作用，并且有利于加快臨床相關(guān)應(yīng)用的發(fā)展。

[關(guān)鍵詞]明膠甲基丙烯酰；細(xì)胞培養(yǎng)；生物材料；組織工程

[中圖分類(lèi)號(hào)]R318.08 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2017）08-0130-04

在過(guò)去的十年中，細(xì)胞培養(yǎng)研究已經(jīng)見(jiàn)證了二維向三維的轉(zhuǎn)變。3D培養(yǎng)的細(xì)胞表現(xiàn)更接近于天然組織中的細(xì)胞。這種轉(zhuǎn)變主要體現(xiàn)在水凝膠應(yīng)用在組織工程中的生物材料方面的研究。在組織工程中，使用這種理想的類(lèi)似于天然細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的水凝膠刺激細(xì)胞形成具有機(jī)械整合性的功能組織，以確保移植物在植入后能繼續(xù)存活。普通的生物材料通常達(dá)不到強(qiáng)度和機(jī)械可調(diào)性的要求，因此在當(dāng)今的生物材料研究中，迫切需要一種兼有生物活性和理化性能的水凝膠。而GelMA與其他可用的水凝膠生物材料相比，能滿(mǎn)足這些要求。這種3D細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)，不僅非常接近天然的細(xì)胞外環(huán)境，而且它為保持組織3D結(jié)構(gòu)提供了可能性。3D組織類(lèi)似物的這種發(fā)展反映了從單層細(xì)胞培養(yǎng)到盤(pán)狀水凝膠中的3D培養(yǎng)，到經(jīng)歷生物成熟的生物制造3D構(gòu)建體，最終可應(yīng)用于修復(fù)體內(nèi)組織缺陷和美容整形。

本文對(duì)GelMA用作細(xì)胞包封水凝膠作一概述，其可用作多種組織工程的基礎(chǔ)材料。重點(diǎn)描述了在最先進(jìn)的生物制造方法中獲得復(fù)雜組織類(lèi)似物中GelMA的應(yīng)用和其在功能方面的發(fā)展，以及這種載細(xì)胞水凝膠基于工程構(gòu)造的再生醫(yī)學(xué)方面的用途。

1細(xì)胞包封

新興的生物制品領(lǐng)域的研究目的是使用活細(xì)胞、生物活性分子、生物材料、細(xì)胞聚集體或雜交細(xì)胞材料制作生物功能性分層的3D構(gòu)建體。

1.1明膠基水凝膠的細(xì)胞包封：明膠廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)及醫(yī)藥加工行業(yè)。在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中，明膠是用于藥物遞送工程“智能”水凝膠的基礎(chǔ)材料。明膠使用領(lǐng)域的增加源于它擁有的生物材料特征，包括生物相容性，生物降解性，低成本和易于操作。此外，它在臨床上，常規(guī)作為血漿擴(kuò)張劑和一些蛋白質(zhì)制劑，也用作疫苗中的穩(wěn)定劑。與膠原蛋白相比，由于熱變性，明膠顯示出很弱的抗原性。重要的是，用于細(xì)胞附著和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）敏感性降解位點(diǎn)的膠原蛋白的生物活性序列保留在明膠骨架中。因此，通過(guò)整合素介導(dǎo)的細(xì)胞粘附和細(xì)胞介導(dǎo)的酶降解可促進(jìn)細(xì)胞的遷移，增殖和分化。將明膠用作生物材料，可通過(guò)共價(jià)交聯(lián)方法克服其在體溫下不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。未修飾的明膠可用其他方式交聯(lián)，以形成共價(jià)網(wǎng)絡(luò)，例如化學(xué)交聯(lián)或酶交聯(lián)?；瘜W(xué)改性后的共價(jià)交聯(lián)與直接交聯(lián)技術(shù)相比，向明膠主鏈中添加官能團(tuán)是一種具有高度控制水凝膠設(shè)計(jì)和性能的交聯(lián)策略。然而，只有少數(shù)方法適合同時(shí)交聯(lián)和細(xì)胞包封。與間接酶交聯(lián)相反，光交聯(lián)能對(duì)交聯(lián)過(guò)程的時(shí)間和空間進(jìn)行控制，這對(duì)于創(chuàng)建空間復(fù)雜的組織類(lèi)似物至關(guān)重要。因此，人們通常使用紫外光（UV）和可見(jiàn)光（VIS）進(jìn)行光交聯(lián)。此外，一些雙重修飾可被用來(lái)改善細(xì)胞行為或增強(qiáng)組織成型性能。大多數(shù)報(bào)道的文獻(xiàn)使用光引發(fā)劑Irgacure2959，與其他光引發(fā)劑相比其細(xì)胞毒性相對(duì)較低。

1.2明膠甲基丙烯酰水凝膠的細(xì)胞包封：GelMA由Van den Bulcke和同事于2000年首次引入。隨后，由于其固有的生物活性和物理化學(xué)的可控性，使它在組織工程領(lǐng)域中引起相當(dāng)大的熱度。GelMA的水凝膠設(shè)計(jì)中的第一步是選擇適當(dāng)程度的明膠的官能化（Do F）。這可以通過(guò)控制用于合成GelMA大分子單體的甲基丙烯酸酐的量來(lái)調(diào)控，以此在（光）引發(fā)劑和能量源的條件下制造水凝膠。生物材料可以依據(jù)設(shè)計(jì)所需的物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)一步調(diào)控以形成特定結(jié)構(gòu)。比如，可以通過(guò)增加聚合物的濃度（常規(guī)為10%）或使用接近80%的Do F的高度功能化的凝膠來(lái)阻止細(xì)胞擴(kuò)散，這歸功于整個(gè)水凝膠的廣泛交聯(lián)。通常，具有20%～80%的Do F的GelMA大分子單體可產(chǎn)生性能穩(wěn)定的水凝膠，且隨著甲基丙烯?；〈陌俜直仍黾?，可生成硬度更大、孔徑更小的水凝膠。在批量合成GelMA時(shí)，光交聯(lián)的光強(qiáng)度，曝光時(shí)間和引發(fā)劑濃度都會(huì)影響所得水凝膠的性質(zhì)。GelMA網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)易受酶降解，特別是易受由（嵌入的）細(xì)胞分泌的MMP局部降解。所有的設(shè)計(jì)參數(shù)都需要對(duì)每個(gè)特定用途進(jìn)行仔細(xì)的調(diào)控，包括硬度，降解概況和所得水凝膠中的預(yù)期細(xì)胞行為。由于GelMA性質(zhì)的這種可調(diào)性，因此適用于組織工程中的許多領(lǐng)域。實(shí)際上，GelMA已經(jīng)應(yīng)用于再生神經(jīng)組織、血管、軟骨、骨、皮膚、骨骼肌、心臟、肝和腎等多個(gè)方面，通過(guò)各種生物加工相關(guān)技術(shù)能夠得到理想的生物材料模型。

1.3通過(guò)微流體策略制造細(xì)胞包封模型：現(xiàn)在已經(jīng)開(kāi)發(fā)了微流體方法，以將細(xì)胞封裝在GelMA液滴中，用于組織工程的各個(gè)方面。此外，引入微流控技術(shù)可制造具有包封細(xì)胞功能的光交聯(lián)GelMA，它表明能通過(guò)凝膠電泳法在電極表面誘導(dǎo)細(xì)胞排列的辦法是可行的。纖維中的這種3D模型可以用作創(chuàng)建組織，以直接和高通量的方式創(chuàng)建高度可行的含細(xì)胞的微量元件。在拉伸包封細(xì)胞的纖維后，實(shí)現(xiàn)與構(gòu)建體中細(xì)胞的接洽。

1.4使用軟立體光刻技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞包封：GelMA也用于各種軟光刻技術(shù)中以制造能進(jìn)行細(xì)胞包封的微組織模型。成功構(gòu)建了以mm為尺度單位，低至100mm的分辨率，能進(jìn)行細(xì)胞封裝的GelMA微組織模型。通過(guò)使用光掩膜，以GelMA的微通道網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)構(gòu)建出骨樣水凝膠模型。這些方法證明細(xì)胞的局部沉積可促進(jìn)骨組織的血管生成和成骨。與微流體相反，立體光刻法能夠直接構(gòu)建3D結(jié)構(gòu)的無(wú)掩模光圖案化技術(shù)。設(shè)計(jì)由軟件處理并分層，通過(guò)動(dòng)態(tài)立體光刻技術(shù)，可以制備具有各種形狀的100～250mm薄切片，在細(xì)胞包封8小時(shí)后細(xì)胞存活率能高達(dá)80%。然而，立體光刻僅限于含有一種生物材料（混合物）和均勻分布的細(xì)胞成型。endprint

1.5以含細(xì)胞的GelMA為組織油墨的生物打?。撼斯饪谭椒ㄖ?，組織類(lèi)似物也可以進(jìn)行生物打印。以GelMA為油墨的3D細(xì)胞來(lái)打印組織結(jié)構(gòu)，最近已經(jīng)成為組織工程中非常有前景的一種方法。研究人員表明，有可能通過(guò)生物打印方法直寫(xiě)出不同架構(gòu)的GelMA結(jié)構(gòu)模型。有的研究將粘度增強(qiáng)成分混入生物材料中可以改善用于印刷GelMA的流變學(xué)特性。例如，將吉蘭糖膠或透明質(zhì)酸添加到GelMA前體溶液中優(yōu)化了油墨的流變性能以更好維持印刷成品的形狀?；蛘呤褂迷鰪?qiáng)生物材料進(jìn)行共沉積。熱塑性塑料如聚己內(nèi)酯（PCL）在可以同時(shí)發(fā)揮這兩種功效，即限定GelMA模體邊界的同時(shí)增強(qiáng)構(gòu)建體的機(jī)械性能。第三種提高細(xì)胞負(fù)載GelMA水凝膠的印刷性的方法取決于明膠固有的溫度依賴(lài)性溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變。將收集板上的印刷纖維在沉積后立即冷卻至5℃，以此來(lái)增強(qiáng)GelMA的物理交聯(lián)和提供足夠的機(jī)械完整性來(lái)完成逐層打印。為了制作復(fù)雜的解剖形狀的構(gòu)建體，可將聚乙烯醇（PVA）和藻酸鹽的混合成分已經(jīng)與GelMA和PCL共同打印。在制成后，除去在水溶液中被用作支撐懸垂幾何形狀的臨時(shí)結(jié)構(gòu)的混合材料，可獲得臨床相關(guān)尺寸的多孔結(jié)構(gòu)，且在制造過(guò)程不影響細(xì)胞活力。

2 GelMA特性的改良

除了GelMA的自身性質(zhì)，也可以進(jìn)行生物刺激來(lái)改進(jìn)細(xì)胞行為或增強(qiáng)機(jī)械性質(zhì)。GelMA的機(jī)械性能可以是可定制的，所以可以制成一定強(qiáng)度和硬度的凝膠。

2.1可增強(qiáng)組織特異性功能的GelMA復(fù)合結(jié)構(gòu)：在復(fù)合材料中，可以實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)GelMA水凝膠生物材料功能的協(xié)同作用。例如，GelMA復(fù)合材料是用磷酸鈣、多糖、透明質(zhì)酸和ECM顆粒等物質(zhì)開(kāi)發(fā)的。此外，合成聚合物，如PCL、聚乙二醇（PEG）和納米粒子也已經(jīng)有與GelMA結(jié)合的研究。

2.2機(jī)械加固：然而，某些生物應(yīng)用需要維持其生物功能性而選擇低硬度時(shí)，這類(lèi)水凝膠的使用就顯示出它的局限性。在這些情況下，可以將GelMA與增強(qiáng)生物材料共混（混合打?。?，即將GelMA結(jié)合到3D打印支架原料上，然后凝膠和支架材料之間的共價(jià)結(jié)合，用于3Dfp刷微細(xì)纖維增強(qiáng)細(xì)胞的凝膠，與單獨(dú)的水凝膠或纖維網(wǎng)相比，硬度增加了54倍。

3 Gel MA水凝膠的應(yīng)用進(jìn)展

GelMA對(duì)于許多組織工程策略的廣泛應(yīng)用強(qiáng)調(diào)其多功能性。然而，需要確定哪種GelMA組合類(lèi)似物最適合。這可能在很大程度上取決于復(fù)合結(jié)構(gòu)中GelMA的作用，其可以給予明膠的組織特異性功能。

3.1 GelMA在工程血管網(wǎng)絡(luò)的應(yīng)用：組織工程主要需要克服的難題是生物材料制作組織支架中，氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)不足。通過(guò)引入微小血管網(wǎng)絡(luò)組織工程材料可以解決這個(gè)問(wèn)題。首先，通過(guò)使用支架，在構(gòu)建體構(gòu)建之后，創(chuàng)建一個(gè)相對(duì)直徑較大的血管床，用來(lái)接種內(nèi)皮細(xì)胞。第二，較小的毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞在大塊材料中的封裝而產(chǎn)生。后一種方法是基于內(nèi)皮細(xì)胞自我組裝去毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的內(nèi)在能力。

3.2 GelMA在組織分化領(lǐng)域的應(yīng)用：除了用于血管化載有細(xì)胞構(gòu)建體的這種普通用途之外，GelMA已經(jīng)廣泛用于組織特異性領(lǐng)域。對(duì)于心臟斑塊的工程領(lǐng)域，將GelMA與碳納米管和氧化石墨烯微球結(jié)合，使之具有導(dǎo)電性。與純GelMA上的培養(yǎng)物相比，在2D復(fù)合貼片上新生大鼠心肌細(xì)胞的功能評(píng)估顯示出了更高的同步跳動(dòng)速率和較低的激發(fā)閾值。在肝組織工程中，肝細(xì)胞微團(tuán)聚體以高通量方式增值并包封在GelMA中，含有包封肝細(xì)胞的GelMA可以作為3D肝印刷的生物源。在骨組織工程中，GelMA與磷酸鈣和人類(lèi)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞（MG63）結(jié)合能增加機(jī)械強(qiáng)度，但目前沒(méi)有研究顯示其對(duì)成骨性有顯著影響。軟骨是另一種承重組織，透明質(zhì)酸直接以濃度依賴(lài)性方式影響軟骨細(xì)胞分化。

3.3組織結(jié)構(gòu)與應(yīng)用：組織類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)主要由（生物）功能和機(jī)械方面決定。目前，所面臨的主要挑戰(zhàn)在于將微組織模型擴(kuò)大到臨床相關(guān)尺寸。制作生物組織的復(fù)雜性在增加，所需要的數(shù)量也是挑戰(zhàn)。例如，構(gòu)建體的技術(shù)難點(diǎn)在于整個(gè)構(gòu)建體的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)移和保持所需的機(jī)械穩(wěn)定性。此外，組織結(jié)構(gòu)的一個(gè)重要方面是包含工程模擬組織的復(fù)雜性。例如，Kolesky和同事在不同的生物群中分離了不同的組織成分（脈管系統(tǒng)，ECM和特異性細(xì)胞）。生物制品組織的這種長(zhǎng)期行為對(duì)于確定需要施加以獲得功能性人體組織類(lèi)似物的建筑復(fù)雜性的水平將是非常有價(jià)值的。

3.4從前臨床角度看GelMA：在臨床研究中獲得了有希望的結(jié)果，證明了GelMA用于臨床應(yīng)用的潛力。軟骨再生是生物材料降解和新組織替代之間平衡的一個(gè)例子，這是組織工程中的關(guān)鍵和最具挑戰(zhàn)性的目標(biāo)之一。GelMA降解性可以對(duì)靶組織的重塑速率進(jìn)行限制。增加Do F將提高機(jī)械性能并延長(zhǎng)所需的降解周期。對(duì)于臨床應(yīng)用，作為基礎(chǔ)材料的GelMA必須滿(mǎn)足幾個(gè)要求：首先，必須考慮GelMA及其降解產(chǎn)物，特別是寡聚甲基丙烯酸酯的體外和體內(nèi)生物相容性。臨床應(yīng)用中的其他挑戰(zhàn)是不同批次的變化及與動(dòng)物衍生材料相關(guān)的可能的疾病傳播。盡管如此，臨床級(jí)明膠現(xiàn)在在臨床上常規(guī)使用，這表明其益處超過(guò)了風(fēng)險(xiǎn)。

4 Ge l MA水凝膠的未來(lái)方向

目前，將組織構(gòu)建體應(yīng)用到臨床所面臨的主要挑戰(zhàn)是將再生方法轉(zhuǎn)變?yōu)橐欢ǖ囊?guī)范程序，同時(shí)保留預(yù)期的再生能力。該轉(zhuǎn)化從GelMA合成和生物打印延伸到細(xì)胞培養(yǎng)方案。例如，GelMA交聯(lián)的金標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)在是Irgacure 2959和UV光。然而，為了避免UV光的相關(guān)缺點(diǎn)，可以選擇可替代的交聯(lián)體系，例如通過(guò)VIS，可以提高GelMA的交聯(lián)度。細(xì)胞的封包進(jìn)一步使GelMA的應(yīng)用復(fù)雜化，因?yàn)榻M織工程產(chǎn)品需要符合高級(jí)治療藥物產(chǎn)品（ATMP）的立法，這種藥物產(chǎn)品仍然是一個(gè)技術(shù)不成熟的領(lǐng)域。因此，GelMA不僅是將半合成生物材料轉(zhuǎn)化為ATMPs的先驅(qū)，而且還可以作為一種“過(guò)渡技術(shù)”，這樣可以進(jìn)一步加速技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室到臨床的應(yīng)用。在此過(guò)程中，GelMA可作為下一代組織類(lèi)似物設(shè)計(jì)的基石。

5結(jié)論

GelMA作為一種組織工程生物材料近年來(lái)已經(jīng)吸引人們?cè)絹?lái)越多的注意力，這歸功于明膠骨架為細(xì)胞提供生物學(xué)支撐并且維持特定的物理化學(xué)性質(zhì)。目前，對(duì)此類(lèi)復(fù)合水凝膠的研究主要集中在3D構(gòu)建體的生成或者非生物構(gòu)建體的長(zhǎng)期細(xì)胞性能研究。

目前所面臨的最大難題是如何將構(gòu)建體尺寸匹配成臨床相關(guān)大小。因此，GelMA的未來(lái)研究應(yīng)集中于生物制造與組織工程的互相配合，在技術(shù)成熟的前提做出尺寸合適的功能性組織等價(jià)物。智能幾何形狀的設(shè)計(jì)、各種材料和組織類(lèi)型的組合、復(fù)雜組織的維持以及推出能參考的指南將是下一步的研究重點(diǎn)。

總之，GelMA是一種有價(jià)值、開(kāi)創(chuàng)性的能用作生物材料以加速組織修復(fù)及各種整形美容方面的臨床解決辦法。endprint