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        4環(huán)HMW—PAHs降解菌的篩選、鑒定及降解特性

        2018-02-06 07:55:27張雪娜賈海濱張麗秀
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年15期
        關(guān)鍵詞:生物降解

        張雪娜 賈海濱 張麗秀

        摘要:利用富集培養(yǎng)法從河北省典型煤礦區(qū)土壤中分離到1株4環(huán)高環(huán)芳烴(HMW-PAHs)降解菌,經(jīng)形態(tài)特征觀察和18S rRNA序列分析確定該菌株為鐮刀菌屬(Fusarium sp.),命名為Y15。通過室內(nèi)搖瓶和土壤培養(yǎng)試驗,研究了其對4環(huán)HMW-PAHs的降解性能。結(jié)果表明,室內(nèi)搖瓶培養(yǎng)7 d后,Y15接種量為100 mL/L時,對初始濃度為 10 mg/L 的芘(Pyr)、苯并[a]蒽(BaA)、[XCZ60.tif](Chry)的降解效率分別為52.94%、32.14%、33.93%。其中,對Pyr的降解率隨初始濃度的升高呈先升高后降低的趨勢,在40 mg/L時降解率最高,為69.67%。Y15接種在PAHs污染的土壤中,經(jīng)30 d培養(yǎng)試驗,Y15對3種高環(huán)芳烴Pyr、BaA、Chry的總降解率為13.15%。在3種PAHs中,Y15對Pry的降解率顯著高于對BaA、Chry的降解率(P<0.05)。從土壤酶活性變化規(guī)律看,與添加滅活菌液的對照組相比,添加菌液處理的土壤多酚氧化酶和過氧化物酶活性明顯降低。綜上所述,該菌株是1株能以4環(huán)HMW-PAHs為唯一碳源且具有高效降解功能的潛在降解菌。

        關(guān)鍵詞:芘;苯并蒽;[XCZ60.tif];生物降解;鐮刀菌

        中圖分類號: S182文獻標(biāo)志碼: A

        文章編號:1002-1302(2017)15-0282-04

        多環(huán)芳烴 (polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是指由2個或2個以上苯環(huán)以角狀、線狀或簇狀組成的一類持久性有機污染物,在環(huán)境中普遍存在,因具有致畸、致癌、致突變的性質(zhì)而受到人們的重視[1-2]。其中,4環(huán)及4環(huán)以上的高環(huán)PAHs(HMW-PAHs),因其疏水性、親脂性、穩(wěn)定性更強,更不易被降解[3-4],對自然環(huán)境和人體健康均造成極大威脅,其中,4環(huán)PAHs 中的芘(Pyr)、[XCZ60.tif](Chry)、苯并[a]蒽(BaA)屬于美國環(huán)境保護局列入優(yōu)先控制污染中的16種PAHs。

        目前,微生物修復(fù)是去除環(huán)境中PAHs的主要方式,微生物系統(tǒng)、多環(huán)芳烴污染物的類型、污染區(qū)域的地質(zhì)化學(xué)條件是解決PAHs污染問題的3個重要條件,在已知污染物類型和污染區(qū)域條件的基礎(chǔ)上,微生物系統(tǒng)成為PAHs生物降解的主導(dǎo)者[5]。從污染土壤中篩選高效降解菌是開展微生物修復(fù)的基礎(chǔ)。白鵬等從石油污染區(qū)土壤分離篩選得到1株芘高效降解菌菌株,菌株ZQ5在30 ℃振蕩培養(yǎng)16 d后對 150 mg/L 芘的降解率為90.31%[6]。李曉明等從焦化廠土壤中篩選出芘降解菌群,還有少量菌種篩選自海洋沉積物或污泥[7],因此,在不同的典型污染土壤中進行篩菌工作對補充菌種資源庫及修復(fù)特定環(huán)境下的PAHs污染問題尤為重要。目前為止,從煤礦區(qū)受PAHs長期污染的農(nóng)田土壤中篩選降解菌株的工作尚未開展,可加強研究。同時,近年來,國內(nèi)外對高分子量PAHs的微生物降解研究較少,而能夠以高分子量PAHs為唯一碳源的微生物資源更少[8]。

        因此,本研究擬通過富集培養(yǎng),從典型煤礦區(qū)多環(huán)芳烴長期污染土壤中篩選高分子量PAHs的高效降解菌,通過形態(tài)學(xué)觀察和18S rRNA序列分子生物學(xué)分析,對菌種進行鑒定,并通過室內(nèi)搖瓶培養(yǎng)試驗和室內(nèi)土壤培養(yǎng)試驗考察其對Pyr、BaA、Chry的降解能力,為微生物修復(fù)4環(huán)HMW-PAHs的環(huán)境提供資源保障和理論依據(jù)。

        1材料與方法

        1.1試驗材料

        供試菌株為筆者課題組前期富集、篩選、馴化、待鑒定的菌株。

        供試土壤采自河北省典型煤礦區(qū)的農(nóng)田污染場地,區(qū)內(nèi)分布有焦化廠和鋼鐵廠等生產(chǎn)企業(yè),土壤樣品為受PAHs長期污染的老化土壤,Pyr、BaA、Chry的總含量達2 019.23 mg/kg。取 0~10 cm表層污染土壤,遮光風(fēng)干后,過1 mm篩,混合均勻后,在4 ℃的冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?,其基本化學(xué)性質(zhì)如表1所示。供試土壤樣品的pH值為7.46。

        多環(huán)芳烴芘(Pyr)、苯并[a]蒽(BaA)、[XCZ60.tif](Chry),均為分析純。

        無機鹽液體培養(yǎng)基:0.20 g MgSO4·7H2O、0.02 g CaCl2·2H2O、0.01 g FeSO4·7H2O、0.40 g KH2PO4、0.60 g Na2HPO4、0.02 g MnSO4·H2O、1.00 g NH4NO3、1.00 L蒸餾水(無機鹽固體培養(yǎng)基在無機鹽液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入 15~20 g瓊脂)。

        高氏一號固體培養(yǎng)基:2.000 g可溶性淀粉、0.050 g氯化鈉、0.110 g硝酸鉀、0.050 g磷酸氫二鉀、0.050 g硫酸鎂、0001 g硫酸亞鐵、1.500~2.000 g瓊脂、100 mL蒸餾水,pH值為7.4~7.6(高氏一號液體培養(yǎng)基在高氏一號固體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上去掉瓊脂)。

        1.24環(huán)HMW-PAHs降解菌的篩選

        富集:于100 mL已滅菌的無機鹽液體培養(yǎng)基中放入5 g農(nóng)田污染場地新鮮的土壤樣品,150 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng) 24 h 獲得富集菌液,取1 mL富集菌液接種到高氏一號培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

        篩選與純化:將上述在高氏一號培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的富集菌液經(jīng)含PAHs的無機鹽培養(yǎng)基進行篩選,并經(jīng)多次轉(zhuǎn)接純化后獲得多株純化菌株。

        馴化:將已篩選出的所有純菌接種到表層含120 μg 4環(huán)PAHs的無機鹽固體培養(yǎng)基中進行沖擊,30 ℃下培養(yǎng)7 d后觀察菌落生長狀況,得到目標(biāo)降解菌株,將所述目標(biāo)降解菌株接種到表層含12、24、48 μg 4環(huán)HMW-PAHs的無機鹽固體培養(yǎng)基中進行逐級馴化,30 ℃下恒溫培養(yǎng)7 d后,生長良好,將馴化后的菌株進行鑒定,并用甘油冷凍保存于-70 ℃冰箱,備用。endprint

        1.34環(huán)HMW-PAHs降解菌的鑒定

        1.3.1形態(tài)觀察及鑒定

        將已充分活化的菌株接種到高氏一號固體培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)48 h后觀察菌落,并在高倍顯微鏡下觀察菌株孢子、菌絲的形態(tài)學(xué)特征。

        1.3.2菌株的分子生物學(xué)鑒定

        以菌株基因組DNA為模板,用真菌核糖體rRNA區(qū)通用引物(ITS1、ITS4)進行18S rRNA擴增,PCR產(chǎn)物進行電泳檢測,將擴增片段回收、測序,根據(jù)18S rRNA的測序結(jié)果,利用Blast軟件在GenBank中與其他已測定的標(biāo)準(zhǔn)菌株的18S rRNA序列進行同源性比較。

        1.4菌株對無機鹽液體培養(yǎng)基中Pyr、BaA、Chry 的降解特性

        1.4.1菌懸液制備

        取1 mL馴化后保存的菌液,接種于高氏一號固體培養(yǎng)基中,30 ℃,150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d后得到目標(biāo)菌株,將其接種于100 mL高氏一號液體培養(yǎng)基中,同樣條件培養(yǎng)48 h后得到富集菌液。

        1.4.2菌株對Pyr、BaA、Chry的降解試驗設(shè)計

        在100 mL三角瓶中加入18 mL無機鹽溶液滅菌后,添加一定量4環(huán)PAHs單體母液,待丙酮揮發(fā)后,接入10%的富集菌液,使PAHs單體Pyr、BaA、Chry的終濃度均為10 mg/L,以不添加富集菌液的處理作為對照組,均在150 r/min、30 ℃搖床中遮光振蕩培養(yǎng)7 d,每個處理設(shè)置3個重復(fù)。試驗方案如表2所示。

        1.6樣品測定指標(biāo)及方法[HJ1.45mm]

        土壤基本理化性質(zhì):采用土壤農(nóng)化常規(guī)分析法[9]測定。

        PAHs無機鹽溶液測定指標(biāo):Pyr、BaA、Chry測定方法參照文獻[10-12]。在三角瓶中加入20 mL色譜純正己烷,超聲提取5 min后,使粘在壁上的PAHs全部浸到正己烷溶液中,再將三角瓶置于250 r/min振蕩器中,振蕩提取40 min后,再次超聲提取5 min,靜置分層后吸取1 mL上層正己烷溶液轉(zhuǎn)移至2 mL頂空進樣瓶中,待測。

        土壤中HMW-PAHs測定指標(biāo)及其分析方法:土壤中PAHs含量以風(fēng)干質(zhì)量計量,稱取20 g土壤樣品及10 g無水硫酸鈉,混合均勻后,加入20 μL替代物(濃度為20 μg/mL的氘代三聯(lián)苯與4-溴-2氟聯(lián)苯的正己烷溶液),用丙酮與正己烷體積比為1 ∶1的提取劑索氏提取12 h,并經(jīng)過干燥、濃縮、凈化、再次濃縮后用正己烷定容至1 mL,待測[12-13]。

        土壤酶活性測定指標(biāo)及其分析方法:土壤多酚氧化酶活性采用鄰苯三酚比色法測定,以1 g風(fēng)干土壤樣品2 h內(nèi)生成的紫色沒食子素的毫克數(shù)表示;土壤過氧化物酶活性測定與多酚氧化酶活性的測定方法相同[14]。

        儀器:氣相色譜儀-質(zhì)譜儀聯(lián)用,氣相色譜儀為安捷倫6890,質(zhì)譜儀為美國HP5972系列。

        質(zhì)量控制:回收率和檢測線的測定參考EPA標(biāo)準(zhǔn)方法,回收率測定采用土壤基質(zhì)加標(biāo)法[15]。

        1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

        無機鹽溶液中多環(huán)芳烴降解率=(對照組PAHs含量-試驗組PAHs含量)/對照組PAHs含量×100%。

        土壤中HMW-PAHs的降解率Rs=(C0-Ct)/C0×100%。其中,C0為對照組土壤中HMW-PAHs的含量,Ct為試驗組土壤中HMW-PAHs的含量。

        試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003和SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。

        2結(jié)果與分析

        2.14環(huán)HMW-PAHs降解菌株的形態(tài)鑒定與18S rRNA分子生物學(xué)鑒定

        菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上30 ℃培養(yǎng) 48 h 后,培養(yǎng)基無色,菌絲生長密致,菌落的表面棉絮狀;分生孢子呈鐮刀形,分生孢子座為淺紫色,0~3個分隔,多數(shù)無隔。

        對菌株的18S rRNA進行PCR擴增,經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得大小約500 bp的產(chǎn)物,擴增產(chǎn)物回收后進行測序,得到18S rRNA的序列為526 bp(圖1)。利用Blast軟件在GenBank中與其他標(biāo)準(zhǔn)菌株的18S rRNA序列進行同源性比較,該菌株18S rRNA序列與鐮刀菌屬真菌的18S rRNA序列相似性高達99%。結(jié)合菌株的形態(tài)特征分析與18S rRNA的結(jié)果,鑒定此菌株為鐮刀菌屬(Fusarium sp.),命名為Y15。

        2.2Y15菌株對無機鹽培養(yǎng)液中Pyr、 BaA、Chry的降解特性

        將Y15菌液加入分別含有10 mg/L Pyr、 BaA、Chry的無機鹽液體培養(yǎng)基中,7 d后測定Y15對3種HMW-PAHs的降解效果。由圖2可知,Y15菌液對Pyr、 BaA、Chry的降解率分別為5294%、32.14%、33.93%。經(jīng)檢驗,Y15菌液對Pyr的降解率顯著高于對BaA、Chry的降解率(P<0.05),說明Y15菌株能夠分別以Pyr、BaA、Chry為唯一碳源和能源進行代謝繁殖。

        由圖3可知,隨著Pyr初始濃度的升高,Y15菌株對Pyr的降解率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,當(dāng)Pyr的濃度為40 mg/L時降解效果較好,降解率高達69.67%,顯著高于對其余兩者的降解率(P<0.05),分別是其余兩者的1.32、2.01倍。由此可見,Y15菌株對高濃度的HMW-PAHs有較強的耐受能力。

        2.3Y15菌株對老化污染土壤中Pyr、 BaA、Chry的降解效果

        由圖4可知,添加Y15菌液的處理中Pyr、 BaA、Chry分別降低了15.02%、11.50%、12.20%,Y15菌株對4環(huán) HMW-PAHs的總降解率達到了13.15%。根據(jù)單體去除效果可知,Y15對土壤中Pyr的降解效果顯著好于對BaA、Chry的降解效果(P<0.05),這說明Y15菌液對老化污染土壤中Pyr、 BaA、Chry均有一定的降解能力,且對Pyr的降解能力較強。endprint

        2.4不同處理下土壤酶活性的顯著性分析

        由表5可知,與對照相比,加入Y15菌液后,土壤多酚氧化酶活性、過氧化物酶活性顯著降低。對照處理土壤多酚氧化酶活性是施加Y15菌液處理中多酚氧化酶活性的1.62倍,與對照組處理相比,施加Y15菌液處理組過氧化物酶活性降低了23.83%。

        3結(jié)論與討論

        經(jīng)過對典型煤礦區(qū)土壤中多環(huán)芳烴含量的檢測,證明土壤已經(jīng)受到高濃度多環(huán)芳烴的嚴(yán)重污染[16]。在本研究中,在典型煤礦區(qū)土壤中分離到1株可分別以Pyr、 BaA、Chry為唯一碳源和能源的降解菌Y15菌株,經(jīng)形態(tài)觀察和18S rRNA分子生物學(xué)分析,初步鑒定其屬于鐮刀菌屬。該菌株能夠利用、降解多種HWM-PAHs。目前,能夠降解HMW-PAHs的菌株一般多為細菌[17-21],真菌中對白腐真菌研究最多[22-24],對鐮刀菌屬降解HMW-PAHs的研究也僅見零星報道[25]。

        在本研究搖瓶培養(yǎng)試驗中,7 d后Y15菌液對初始濃度為10 mg/L的Pyr、 BaA、Chry降解率達52.94%、32.14%、33.93%。而Ortega-González等以50 mg/L的Pyr為唯一碳源,14 d后,鐮刀菌屬對Pyr的降解率為51.32%[25];絲狀真菌宛氏擬青霉30 d對BaA的單一體系的降解率為1718%[26]。這可能是由于菌株篩選地點不同其降解PAHs的能力存在差異,也可能是由搖瓶試驗培養(yǎng)的環(huán)境、時間不同所致。從煤礦區(qū)土壤篩選的鐮刀菌屬Y15菌株是一種優(yōu)良的4環(huán)HMW-PAHs降解菌,對4環(huán)HMW-PAHs具有很好的降解潛力。此外,Y15對較高濃度及較低濃度的Pyr均有一定的降解效果,但是降解效果顯著低于最適降解濃度(P<0.05),這與其他學(xué)者的研究結(jié)果[6,27-28]一致??赡苁怯捎赮15將Pyr作為唯一碳源,Pyr濃度過低則菌體對底物的競爭作用會影響其生長,或者是 PAHs濃度低時不能快速誘導(dǎo)產(chǎn)生裂解酶[27];而過高濃度的Pyr以及Pyr代謝的中間產(chǎn)物的累積可能對降解菌起到了一定的毒害作用[6,28],抑制了Y15的生長。

        土壤培養(yǎng)試驗中,通過向滅菌老化污染土壤的土壤樣品中添加鐮刀菌屬Y15菌株的菌液以提高 PAHs 的降解效率,Y15菌液對Pyr、 BaA、Chry降解率分別為15.02%、1150%、12.20%,對4環(huán)PAHs的降解率為13.15%。Potin等將鐮刀菌屬等降解菌加入到未滅菌老化土壤中,30 d后,鐮刀菌屬對4環(huán)PAHs的降解率為22%[29],這可能是由土壤的理化性質(zhì)、菌種、接菌量不同所致[30],也可能是因為鐮刀菌菌液中營養(yǎng)物質(zhì)加入未滅菌土壤中影響了土著微生物的生長,促進其生長,提高PAHs的降解效果[31]。就土壤酶活性而言,多酚氧化酶活性與對照組相比顯著降低(P<0.05),與Liu等的結(jié)論[32]一致。

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