樊淼 ，張溶津，劉 琤，李 軍

（杭州醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053）

隨著非水酶學(xué)的發(fā)展，生物催化技術(shù)已廣泛用于合成手性藥物[1-3]。由于水相催化出現(xiàn)諸如水難溶底物溶解性差，底/產(chǎn)物的細胞毒性等問題，制約著生物合成領(lǐng)域的發(fā)展[4-6]。近年來，作為環(huán)境友好的綠色溶劑，離子液體為生物催化反應(yīng)提供了不同于水相和傳統(tǒng)有機溶劑的介質(zhì)環(huán)境，因其獨特的化學(xué)性質(zhì)使基于離子液體介質(zhì)生物催化成為近年來醫(yī)藥化工的研究熱點之一[7-8]。離子液體種類較多，但適于構(gòu)建生物合成手性藥物反應(yīng)體系的離子液體種類較少，而離子液體的生物相容性研究是開發(fā)適于生物催化離子液體的關(guān)鍵。研究表明，部分離子液體對微生物細胞生長具有抑制作用，影響細胞代謝及細胞膜完整性，因此離子液體生物相容性研究十分必要[9-12]。采用離子液體構(gòu)建生物合成反應(yīng)體系時，應(yīng)考慮離子液體的生物相容性，研究離子液體對細胞的毒性、細胞存活率及代謝活性等因素。通過不同種類離子液體對微生物細胞的生物相容性研究，得出離子液體結(jié)構(gòu)與其生物相容性之間的構(gòu)效關(guān)系，從而構(gòu)建高效反應(yīng)體系用于生物合成手性藥物。

1 實驗部分

1.1 主要實驗儀器及設(shè)備

生化培養(yǎng)箱（SHP-150），立式壓力蒸汽滅菌器（MLS-3750），生物安全柜（HF1200），恒溫搖床（TS-200B），電子天平 （AL204），多功能酶標(biāo)儀（SpectraMax M2e），安捷倫氣相色譜儀（7820A）。

1.2 主要試劑

E.coli BL21（DE3）為本實驗室構(gòu)建基因重組菌，基因序列ScCR （GenBank Accession No.NC 003888.3）由上海生工合成；葡萄糖測定試劑盒，4-氯乙酰乙酸乙酯，（R）-3-羥基丁酸乙酯及其它化學(xué)試劑均為市售化學(xué)純、分析純或生化試劑。

1.3 離子液體種類

實驗中所用離子液體見表1。

表1 實驗離子液體種類與縮寫Table 1 Ionic liquids used in the experiment

1.4 細胞糖代謝活力測定

離子液體對細胞代謝活性的影響可由菌體細胞的糖代謝保留值來表征。細胞代謝活性保留定義為：經(jīng)離子液體處理后的細胞糖代謝率與未經(jīng)離子液體處理（即空白對照）的細胞糖代謝率的比值。具體實驗過程如下：0.1 g E.coli BL21（DE3） 菌體懸浮于 20 mL PBS （Na2HPO4/NaH2PO4；pH=6.5）中，再加入適量離子液體，以不加離子液體組為空白對照，在30℃，200 rpm條件下24 h；取出菌懸液，收集菌體，經(jīng)蒸餾水洗滌后，加入10 g/L葡萄糖水溶液20 mL，繼續(xù)在搖床30℃，200 r/min條件下恒溫保持4 h，8000 rpm離心10 min收集上清液，用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法測得殘?zhí)?，以此計? h內(nèi)細胞的糖代謝率。

1.5 細胞膜通透性測定

0.1 g E.coli BL21（DE3）菌體懸浮于含一定量含離子液體的 PBS溶液中（Na2HPO4/NaH2PO4；pH=6.5），以不含離子液體的PBS為對照，于30℃，200 r/min條件下孵化6 h。8000 r/min離心10 min，收集上清液。檢測260 nm和280 nm處吸光值以確定樣品中核酸和蛋白質(zhì)的含量，即可得出離子液體對細胞膜通透性的影響。

1.6 E.coli BL21（DE3）催化不對稱還原反應(yīng)及氣相色譜分析法

反應(yīng)體系：0.1 g E.coli BL21（DE3）菌體于250 mL搖瓶中，并在 20 mL PBS（Na2HPO4/NaH2PO4；pH=6.5）中懸浮細胞，加入 20% （v/v）異丙醇，添加4-氯乙酰乙酸乙酯底物，構(gòu)建含離子液體介質(zhì)體系時，親水性離子液體添加量為5%（v/v）， 疏水性離子液體添加量為 15% （v/v），于30℃、200 r/min的搖床中反應(yīng)24 h。

氣相色譜分析方法：底物和產(chǎn)物檢測采用氣相色譜法。氣相色譜條件：安捷倫GC-7820A氣相色譜儀，色譜柱為Varian CP-Chirasil-Dex手性毛細管氣相色譜柱 （25 m×0.25 mm×0.25 μm， df=0.25）。載氣為氮氣，流量為2.0 mL/min；色譜柱溫度90℃ ～150℃；升溫速度：10℃/min；檢測器和進樣口溫度均為250℃，檢測器為FID；進樣量1 μL，分流比為 20 ∶1。

2 結(jié)果與討論

2.1 親水性離子液體對E.coli BL21（DE3）糖代謝能力影響

圖1 親水性離子液體對E.coli BL21（DE3）糖代謝能力的影響Fig.1 Effect of hydrophilic ILs on sugar metabolic activity retention （MAR） of E.coli BL21（DE3）

離子液體由于其不易揮發(fā)、溶解能力強等特性，通常被認(rèn)為是綠色溶劑，而不同離子液體對生物催化劑的毒性不同。首先研究咪唑、吡啶等八種親水性離子液體對重組基因工程菌E.coli BL21（DE3）細胞糖代謝活力的影響，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)離子液體的陰離子相同時，離子液體陽離子對細胞的毒性順序為：[N2，2，2，2]+＜ [Epy]+＜[EMMP]+＜ [P1，2]+＜ [EMIM]+＜ [PP1，4]+＜ [DMIM]+＜[BMIM]+。以上研究結(jié)果表明，八種親水性離子液體對E.coli BL21（DE3）細胞均有毒性，其中季銨型離子液體[N2，2，2，2][BF4]對細胞糖代謝能力影響最小，其次是吡啶類和嗎啉類離子液體。

2.2 親水性離子液體對E.coli BL21（DE3）細胞膜通透性影響

離子液體可改善細胞膜的通透性，在反應(yīng)體系中添加離子液體可提高底/產(chǎn)物發(fā)生酶促反應(yīng)速率，并減少底/產(chǎn)物抑制。離子液體對細胞膜通透性影響研究結(jié)果如圖2所示，八種離子液體均可增加細胞膜通透性，但也增加了細胞死亡率。與對照相比，含[N2，2，2，2][BF4]體系可適度增加細胞膜通透性，且季銨鹽離子液體的細胞糖代謝能力較佳。 因此，[N2，2，2，2][BF4]被認(rèn)為是生物相容性較好的反應(yīng)體系可用于生物合成。

表2 親水性離子液體對細胞膜透性的影響Table 2 Effect of various hydrophilic ionic liquids on cell membrane permeability

2.3 親水性離子液體對E.coli BL21（DE3）催化還原反應(yīng)影響

生物相容性實驗結(jié)果表明，季銨鹽離子液體[N2，2，2，2][BF4]對 E.coli BL21 （DE3） 細胞具有較好的生物相容性。含該離子液體介質(zhì)中E.coli BL21（DE3）生物不對稱催化還原制備（R）-3-羥基丁酸乙酯反應(yīng)效率如表3所示。與對照相比，含[N2，2，2，2][BF4]、[PP1，4][BF4]、[EMIM][BF4]離子液體介質(zhì)反應(yīng)體系可有效提高生物催化產(chǎn)率，基于不同離子液體介質(zhì)中E.coli BL21（DE3）催化效率如下：[N2，2，2，2][BF4]＞ [PP1，4][BF4]＞ [EMIM][BF4]＞[EMMP][BF4]＞[BMIM][BF4]＞[Epy][BF4]＞[DMIM][BF4]＞ [P1，2][BF4]。以上研究結(jié)果表明，親水性離子液體的生物相容性規(guī)律與催化效率不完全一致，但生物相容性最好的季銨型離子液體[N2，2，2，2][BF4]的催化效率最高，達 97.1%，ee 值為99%。

表3 親水性離子液體對生物不對稱還原反應(yīng)的影響Table 3 Effect of various hydrophilic ILs on the biocatalytic reaction

2.4 疏水性離子液體對E.coli BL21（DE3）細胞糖代謝活力影響

圖2 疏水性離子液體對E.coli BL21（DE3）糖代謝能力影響Fig.2 Effect of hydrophobic ILs on MAR of E.coli BL21（DE3）

由于反應(yīng)底物多為水難溶性化合物，而疏水性離子液體可增加底物在反應(yīng)體系中的溶解性。因此，研究不同種類疏水性離子液體對E.coli BL21（DE3）糖代謝活力影響，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)離子液體的陰離子相同時，離子液體陽離子對細胞的毒性順序為：[N2，2，2，2]+＜ [Epy]+＜ [EMMP]+＜ [P1，2]+＜ [EMIM]+＜ [PP1，4]+＜ [DMIM]+＜[BMIM]+。結(jié)果與親水性離子液體對E.coli BL21（DE3）糖代謝活力影響規(guī)律一致，季銨型離子液體的生物相容性最好。

2.5 疏水性離子液體對E.coli BL21（DE3）細胞膜通透性影響

不同疏水性離子液體對細胞膜通透性影響結(jié)果如表4所示，與親水性離子液體相比，疏水性離子液體更能增加細胞膜通透性，但細胞毒性隨之增加，尤其以咪唑類離子液體毒性最大，其可能已導(dǎo)致細胞死亡。與對照相比，[N2，2，2，2][PF6]與親水性離子液體[N2，2，2，2][BF4]一樣，可適度增加細胞膜通透性，增加底物發(fā)生酶促反應(yīng)效率。

表4 疏水性離子液體對細胞膜通透性的影響Table 4 Effect of various hydrophobic ILs on cell membrane permeability

2.6 疏水性離子液體對E.coli BL21（DE3）催化反應(yīng)影響

疏水性離子液體可通過增加水難溶性底物的溶解性提高生物合成效率，結(jié)果如表5所示。與對照相比， 體系中添加 [PP1，4][PF6]和[N2，2，2，2][PF6]兩種離子液體可提高不對稱還原效率。 且當(dāng)體系中添加[N2，2，2，2][PF6]后，產(chǎn)物產(chǎn)率達最高，表現(xiàn)出較好的催化性能。所有離子液體對手性化合物ee值無影響。

3 結(jié)論

通過細胞糖代謝能力和細胞膜通透性研究了不同離子液體與重組工程菌E.coli BL21（DE3）的生物相容性，并構(gòu)建基于離子液體介質(zhì)生物催化不對稱還原反應(yīng)體系，并研究其催化性能。研究結(jié)果表明季胺型離子液體[N2，2，2，2][BF4]是生物相容性最好的溶劑，且催化性能最佳。通過對離子液體的生物相容性研究，為構(gòu)建高效生物合成手性藥物反應(yīng)體系提供參考，從而推動手性藥物高效合成新技術(shù)快速發(fā)展。

表5 疏水性離子液體對E.coli BL21（DE3）催化反應(yīng)的影響Table 5 Effect of various hydrophobic ILs on biocatalytic reaction

[1] Ma S K，Gruber J，Davis C，et al.A green-by-design biocatalytic process for atorvastatin intermediate[J].Green Chem，2010，12：81-86.

[2] Desai A A.Sitagliptin manufacture：a compelling tale of green chemistry， process intensi fication， and industrial asymmetric catalysis[J].Angew Chem Int Ed， 2011， 50：1974-1976.

[3] Ghislieri D，Green A P，Pontini M，et al.Engineering an enantioselective amine oxidase for the synthesis of pharmaceutical building blocks and alkaloid natural products[J].J Am Chem Soc， 2013， 135： 10863-10869.

[4] Patel R N.Biocatalytic synthesis of intermediates for the synthesis of chiral drug substances[J].Curr Opin Biotechnol， 2001， 12 （6）： 587-604.

[5] Solano D M， Hoyos P， Hernáiz M J， et al.Industrial biotransformations in the synthesis of building blocks leading to enantiopure drugs[J].Bioresourc technol， 2012， 115：196-207.

[6]Matsuda T，Yamanaka R，Nakamura K.Recent progress in biocatalysis for asymmetric oxidation and reduction[J].Tetrahedron Asymmetr， 2009， 20 （5）： 513-557.

[7] Dai L Y，Yu S Y，Shan Y K，et al.Novel room temperature in organic ionic liquids[J].Eur J Inorg Chem，2010，2004 （2）： 237-241.

[8] Petkovic M，F(xiàn)erguson J，Bohn A，et al.Exploring fungal activity in the presence of ionic liquids[J].Green Chem，2009，11： 889-894.

[9] Cull S G，Holbrey J D，Vargas-Mora V，et al.Roomtemperature ionic liquids as replacements for organic solvents in multiphase bioprocess operations[J].Biotechnol Bioeng， 2000， 69： 227-233.

[10]Br?utigam S， Dennewald D， Schürmann M， et al.Wholecell biocatalysis：Evaluation of new hydrophobic ionic liquids for efficient asymmetric reduction of prochiral ketones[J].Enzym Microb Technol， 2009， 45： 310-316.

[11]Xu P，Zheng G W，Du P X，et al.Whole-cell biocatalytic processes with ionic liquids[J].ACS Sustainable Chem Eng，2016，4：371-386.

[12]Tao Y，Dong R，Pavlidis I V，et al.Using imidazoliumbased ionic liquids as dual solvent catalysts for sustainable synthesis of vitamin esters：inspiration from bio-and organo-catalysis[J].Green Chem，2016，18：1240-1248.