楊宇奇，蔣曙紅，韓小亞，江麗華，虞 斌，朱 偉

(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇省常州市婦幼保健院實(shí)驗(yàn)室 213003)

串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)是新生兒篩查領(lǐng)域最重大的進(jìn)展之一[1-2]，可實(shí)現(xiàn)同時(shí)進(jìn)行數(shù)十種代謝物分析，檢測(cè)出包括氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酸氧化代謝紊亂在內(nèi)的多種遺傳代謝性疾病。本課題組已開(kāi)展新生兒遺傳代謝病篩查工作15年，收到了很好的效果[3-4]。近年來(lái)，逐步拓展篩查病種，采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)一次檢測(cè)可篩查27種疾病，也收到了一定效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 2015年4月至2016年12月在常州市婦幼保健院出生的新生兒，共20 027例(男10 665例、女9 362例)，年齡3～4 d，包括正常新生兒14 568例、早產(chǎn)兒(<37周)2 437例、低體重兒(<2 500 g)1 477例、巨大兒(>4 000 g)1 545例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。

1.2方法

1.2.1儀器與試劑 Waters AcquityTM TQD串聯(lián)質(zhì)譜儀、Waters 2777C自動(dòng)進(jìn)樣器、Waters 1525高效液相色譜儀泵由美國(guó)Waters公司提供；采用PerkinElmer公司的非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測(cè)定試劑盒(NeoBase Non-derivatized MSMS Kit,美國(guó)PerkinElmer公司出品)進(jìn)行篩查檢測(cè)，該試劑盒可檢測(cè)11種氨基酸，31種肉堿指標(biāo)和1種酮類(lèi)。

1.2.2標(biāo)本采集 按照“新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范(2010版)”,出生后72 h、充分哺乳6次后，足跟采集4個(gè)血斑，懸空平置自然干燥成深褐色，塑料袋內(nèi)封口，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)送至分中心實(shí)驗(yàn)室，置4 ℃冰箱保存?zhèn)錂z。

1.2.3實(shí)驗(yàn)操作 首先從濾紙片上打下3.2 mm左右的血斑放入V底微孔板，每孔加入100 μL內(nèi)標(biāo)工作液，黏貼膜封板，孵育振蕩45 min，溫度45 ℃，轉(zhuǎn)速650～750 r/min，然后轉(zhuǎn)移75 μL至V型無(wú)包被潔凈微孔板，靜置2 h后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4可疑陽(yáng)性的判讀 由兒科醫(yī)生結(jié)合臨床表現(xiàn)、生化代謝途徑等分析標(biāo)本檢測(cè)值判讀出可疑陽(yáng)性。首先原血片復(fù)查一次，如果復(fù)查結(jié)果和第一次結(jié)果一致進(jìn)行召回復(fù)查；如果檢測(cè)值明顯高于截?cái)嘀档模⒓凑倩貜?fù)查。

1.2.5確診實(shí)驗(yàn) 對(duì)篩查陽(yáng)性的標(biāo)本，根據(jù)其檢測(cè)值和臨床表現(xiàn)選擇做一些生化檢測(cè)如：血常規(guī)、肝腎功能、心肌酶譜、血?dú)?、血糖、血氨、乳酸、丙酮酸等。?duì)部分疑似氨基酸、有機(jī)酸代謝病加做尿氣相色譜(GC/MS)，對(duì)高度懷疑的遺傳代謝疾病做目標(biāo)基因的檢測(cè)。

1.2.6隨訪與治療 所有陽(yáng)性患兒均建立治療隨訪檔案。由于遺傳代謝病種類(lèi)繁多且大多疾病較為罕見(jiàn)，尚未有統(tǒng)一的治療辦法，因此參照顧學(xué)范主編的《臨床遺傳代謝病》[5]對(duì)每種遺傳代謝病進(jìn)行對(duì)癥治療。

2 結(jié) 果

2.1篩查一般情況 20 027例接收串聯(lián)質(zhì)譜篩查的新生兒中，電話(huà)召回重新采血復(fù)查237例，初篩陽(yáng)性率為1.20%，初篩陽(yáng)性召回率94.50%，經(jīng)召回復(fù)查檢測(cè)發(fā)現(xiàn)38例可疑陽(yáng)性，篩查陽(yáng)性率0.19%，最終確診8例，總陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為3.38%。見(jiàn)表1。

2.2確診陽(yáng)性患兒情況 召回復(fù)查仍為陽(yáng)性者結(jié)合生化檢測(cè)和基因檢測(cè)，最終確診新生兒遺傳代謝病8例(男4例，女4例)，總體發(fā)病率為1∶2 503，其中氨基酸代謝異常4例：分別為苯丙酮尿癥(PKU)2例、高甲硫氨酸血癥(MIM)1例、瓜氨酸血癥Ι型(CTLN1)1例；有機(jī)酸代謝異常4例：分別為戊二酸血癥Ι型(GA-1)2例、3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥(MCCD)1例、甲基丙二酸血癥(MMA)1例；尚未有確診的脂肪酸氧化代謝異常疾病。6例患兒(常見(jiàn)PKU病例除外)初篩檢測(cè)(串聯(lián)非衍生化法)、確診檢測(cè)及基因檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3篩查假陽(yáng)性情況 整體篩查假陽(yáng)性達(dá)1.16%，其中以篩查 脂肪酸氧化代謝障礙假陽(yáng)性率最高，氨基酸代謝障礙其次，有機(jī)酸代謝障礙最低。在所檢測(cè)的43項(xiàng)指標(biāo)中，游離肉堿(C0)、瓜氨酸(CIT)和酪氨酸(TYR)等指標(biāo)的異常占總假陽(yáng)性的比例較高，分別為43.4%、12.9%和6.8%。

表1 常州地區(qū)新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查整體情況

-:無(wú)數(shù)據(jù)

表2 8例確診患兒檢測(cè)結(jié)果

續(xù)表2 8例確診患兒檢測(cè)結(jié)果

2.4隨訪與治療 2例PKU患兒囑飲食控制，根據(jù)苯丙氨酸水平調(diào)整飲食，開(kāi)始每周復(fù)查一次，待穩(wěn)定后延長(zhǎng)復(fù)查時(shí)間(1月、2月、半年)。2例戊二酸血癥限制蛋白攝入、食用特殊奶粉以及通過(guò)左旋肉堿和維生素B12藥物治療，每3個(gè)月隨訪1次。1例高甲硫氨酸血癥和2例3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥不予特殊治療囑咐患兒定期隨訪。1例瓜氨酸I型血癥患兒，監(jiān)測(cè)血氨和血串聯(lián)，3月隨訪一次。7例患兒現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育良好。1例甲基丙二酸患兒出生1周后因新生兒肺炎入院治療出現(xiàn)急性代謝紊亂，家屬要求放棄治療，患兒死亡。

3 討 論

眾所周知，新生兒疾病篩查是重要的出生缺陷防治三級(jí)預(yù)防手段，在提高兒童健康方面發(fā)揮了巨大作用。近年來(lái)，新篩技術(shù)的不斷進(jìn)步，不僅提高了篩查工作的效率，同時(shí)也降低了臨床的漏診率和誤診率。一些發(fā)達(dá)國(guó)家早在上世紀(jì)90年代初就開(kāi)展了串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)技術(shù)進(jìn)行遺傳代謝病的篩查[6]，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)成為新生兒疾病篩查最重大的發(fā)展之一。

本課題組自2015年開(kāi)始采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于常州地區(qū)新生兒遺傳代謝病的篩查，至今篩查了20 027例，發(fā)現(xiàn)了8例陽(yáng)性患兒，總發(fā)病率為1∶2 503，與報(bào)道的總體發(fā)病率1∶2 000大致相仿[7]，但明顯高于上海和浙江等地。8例陽(yáng)性病人中4例為氨基酸代謝病、4例為有機(jī)酸代謝病，尚未確診發(fā)現(xiàn)脂肪酸氧化代謝病例，可能與脂肪酸氧化代謝障礙發(fā)病率低且篩查例數(shù)尚少，開(kāi)展的區(qū)域比較局限有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，新生兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查總的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為3.38%，氨基酸陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為5.13%，有機(jī)酸代謝9.50%，與美國(guó)研究結(jié)果較為接近[8]。筆者發(fā)現(xiàn)因氨基酸異常召回的假陽(yáng)性中，異常的指標(biāo)主要集中在CIT和TYR上，其中CIT占了假陽(yáng)性的12.90%、TYR占了6.80%。同時(shí)在召回復(fù)查的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)因TYR偏高而召回的初篩陽(yáng)性者均存在黃疸較高或?yàn)樵绠a(chǎn)兒的情況，尤其是召回復(fù)查的早產(chǎn)兒均有不同程度的TYR增高，這與許多文獻(xiàn)報(bào)道[9-10]早產(chǎn)兒、低體重兒和黃疸患兒體內(nèi)某些氨基酸會(huì)有升高或降低的現(xiàn)象相符合。這可能是由于早產(chǎn)或(和)低體重兒因機(jī)體各器官發(fā)育不成熟，機(jī)體的正常代謝機(jī)制亦尚未完善；同時(shí)由于一些氨基酸與肝臟的受損和修復(fù)相關(guān)，在修復(fù)的過(guò)程中氨基酸會(huì)有升高的現(xiàn)象，所以在這些早產(chǎn)兒、低體重兒、黃疸患兒中會(huì)有氨基酸異常升高的情況。CIT異常多因偏低召回，但未有文獻(xiàn)報(bào)道何種原因會(huì)導(dǎo)致血片中的CIT偏低。有文獻(xiàn)證明血片的質(zhì)量影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[11-12]，筆者在總結(jié)日常工作經(jīng)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)在某些采血不規(guī)范的情況下會(huì)造成CIT偏低，具體情況有待進(jìn)一步探察研究。在20 027例標(biāo)本中未發(fā)現(xiàn)1例脂肪酸氧化代謝異常，但因肉堿指標(biāo)異常召回的占了假陽(yáng)性的71.50%，其中C0偏低占假陽(yáng)性43.40%，C3偏高占11.80%。新生兒體內(nèi)的C0和C3受體重、胎齡、黃疸以及母源性缺乏和季節(jié)變化等影響因素較多[9,12-15]，本課題組統(tǒng)一在嬰兒出生后72 h采血，有時(shí)候無(wú)法完全避免這些影響因素，這可能是導(dǎo)致脂肪酸氧化代謝病的假陽(yáng)性過(guò)高的主要原因。

本研究顯示串聯(lián)檢測(cè)雖然敏感性高，但是假陽(yáng)性率亦高。如何降低假陽(yáng)性率減少召回人數(shù)，降低一些初篩陽(yáng)性新生兒家長(zhǎng)的焦慮是急切要做的事情。課題組開(kāi)展串聯(lián)項(xiàng)目之初采用的是結(jié)合了浙江兒童醫(yī)院近80萬(wàn)篩查數(shù)據(jù)分析和國(guó)內(nèi)權(quán)威專(zhuān)家的數(shù)據(jù)解讀經(jīng)驗(yàn)設(shè)定的參考范圍。遺傳代謝病的發(fā)病率因地域和人種而不同，同時(shí)許多研究表明早產(chǎn)、低體重兒存在腸道外營(yíng)養(yǎng)都會(huì)影響氨基酸及酰基肉堿濃度變化，不同出生體重標(biāo)記物的截?cái)嘀狄部赡懿煌?。因此需要參考胎兒的體重、胎齡、是否黃疸、采血時(shí)間等來(lái)設(shè)定截?cái)嘀?，隨著臨床判讀經(jīng)驗(yàn)的不斷累積也要相應(yīng)的去優(yōu)化截?cái)嘀?，從而提高?yáng)性預(yù)測(cè)值，降低假陽(yáng)性率。

[1]MATERN D,GAVRILOV D,OGLESBEE D,et al.Newborn screening for lysosomal storage disorders[J].Semin Perinatol,2015,39(3):206-216.

[2]KUEHN B M.After 50 years,newborn screening continues to yield public health gains[J].JAMA,2013,309(12):1215-1217.

[3]許國(guó)鋒，王秋偉，王淮燕，等．常州市近十年新生兒遺傳代謝性疾病篩查結(jié)果分析[J]．江蘇醫(yī)藥，2012，38(20)：2450-2452．

[4]王秋偉，王淮燕，蔣健，等．常州地區(qū)新生兒先天性甲狀腺功能減退癥十年篩查結(jié)果分析[J]．中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2012，15(36)：4247-4249．

[5]顧學(xué)范，王偉，王建設(shè)，等．臨床遺傳代謝病[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2015．

[6]葉軍．新生兒遺傳代謝病篩查發(fā)展及診治規(guī)范[J]．中國(guó)計(jì)劃生育和婦產(chǎn)科，2016，8(1)：6-13．

[7]黃新文，楊建濱，童凡，等．串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)新生兒遺傳代謝病篩查及隨訪研究[J]．中華兒科雜志，2011，49(10)：765-770．

[8]KWON C,FARRELL P M.The magnitude and challenge of false-positive newborn screening test results[J].Arch Pediatr Adolesc Med,2000,154(7):714-718.

[9]林飛，徐鈺琪，闕婷，等．新生黃疸患兒與早產(chǎn)低體質(zhì)量?jī)后w內(nèi)氨基酸水平變化原因分析[J]．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2014，11(21)：2947-2949．

[10]龔振華，田國(guó)力，呂志寶，等．串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)?；鈮A和氨基酸在鑒別嬰兒黃疸中的應(yīng)用[J]．中華小兒外科雜志，2012，33(3)：201-205．

[11]DEMIREV P A.Dried blood spots:analysis and applications[J].Anal Chem,2013,85(2):779-789.

[12]尚世強(qiáng)，楊建濱，王治國(guó)．新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查存在的問(wèn)題及展望[J]．中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2016，39(4)：237-239．

[13]傅慧青，高平明，陸鎮(zhèn)奇，等．早產(chǎn)小于胎齡兒生后早期血漿游離肉堿變化特點(diǎn)[J]．中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2015，10(29)：38-39．

[14]韓田駿，林敏詩(shī)，郭勇．孕婦血漿游離肉堿水平與胎兒生長(zhǎng)受限的相關(guān)性研究[J]．廣州醫(yī)藥，2014，45(3)：13-15．

[15]董麗萍，牟凱，朱峰，等．山東魯中地區(qū)新生兒體內(nèi)游離肉堿及酰基肉堿的變化特點(diǎn)[J]．中國(guó)婦幼保健，2016，31(13)：2671-2675．