李亞莉，侯 棟，岳宏忠，張東琴

（甘肅省農業(yè)科學院蔬菜研究所，甘肅 蘭州 730070）

黃瓜是世界范圍內廣泛栽培的重要蔬菜作物之一，中國黃瓜栽培面積位居全國保護地栽培面積之首，對中國蔬菜市場的穩(wěn)定和蔬菜的均衡供應起到了非常關鍵的作用［1］。土傳病害是植物病害研究領域的難題［2］，而在黃瓜栽培中，枯萎病是一種嚴重的土傳病害［3］。黃瓜枯萎病由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum Owen）引起，又名萎蔫病、蔓割病、死秧病，是一種由土壤傳染，從根或根莖部侵入，在維管束內寄生的系統(tǒng)性病害［4-7］。由于土傳病害以土壤為媒介進行傳播，具有極強的隱蔽性，同時尖孢鐮刀菌對不良環(huán)境具有較強抵抗力，以菌絲體、厚垣孢子等在土壤中存活5～6 a之久［8］，在土壤和空氣中能夠存活10 a以上且仍具有很強的致病力［9］，在溫度、濕度和pH等適宜的條件下，能重新快速繁殖，導致病害發(fā)生。該病一旦發(fā)生將產生嚴重的經濟損失，病害發(fā)生嚴重時甚至絕收，因此黃瓜枯萎病的防治一直是黃瓜病害防治的難點［10-11］。目前，沒有防治黃瓜枯萎病的特效藥，輪作倒茬雖然有效，但給蔬菜生產者的茬口安排帶來了實際困難；嫁接防治枯萎病要掌握一定的嫁接技術，且成本較高，相比之下，選育抗病品種才是防治黃瓜枯萎病最經濟、安全、高效的措施［12-13］。而種質資源的抗病性鑒定及明確抗性遺傳規(guī)律是選育抗病品種的基礎。2015—2016年，甘肅省農業(yè)科學院蔬菜研究所以保存的33份黃瓜核心種質為試材，通過苗期接種和成株期自然感染兩種方法，客觀評價其抗病、感病水平，以期篩選出一些抗病種質，進一步明確黃瓜枯萎病的抗性遺傳特性，將利用雜交、回交等遺傳改良手段，實現材料的快速創(chuàng)新，為選育抗枯萎病的黃瓜品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試黃瓜種質33份及6份F1代雜交組合。對照抗病品種為迷你1號，感病對照品種為京研2號，以上材料均由甘肅省農業(yè)科學院蔬菜研究所黃瓜育種課題提供。供試菌種為尖孢鐮刀菌黃瓜專化型 ［Fusarium oxysporum（Schl.）f.sp.cucumerinum Owen.］生理小種4號，由北京農林科學院蔬菜研究中心提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 苗期抗性鑒定 苗期抗性鑒定采用胚根接種法［14］，稍有改動。孢子懸浮液的制備：將保存?zhèn)溆玫木N接種到PDS培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)皿中布滿菌絲后，倒入少許滅菌水，刮取菌絲，用雙層紗布過濾，除去菌絲，將濾液經5 000 rpm離心10min，取其沉淀物，加蒸餾水稀釋成1×106個/mL的孢子懸浮液，備用。接種方法：將催芽后胚根長約1cm的種子，浸入配制好的孢子懸浮液中30min，然后傾出孢子懸浮液，將種子播于育苗盤中。試驗隨機區(qū)組排列，3次重復，每重復10株苗。每天視基質濕度適量澆水，并隨機挪動育苗盤，觀察幼苗的發(fā)病情況。在感病對照品種發(fā)病盛期進行調查，調查2次，求平均值。病情調查及分級：0級，無病癥；1級，胚軸及子葉癥狀輕微，子葉失去光澤；2級，植株輕度萎蔫，胚軸出現壞死斑，或一片子葉黃化；3級，植株中度萎蔫，子葉下垂或僵化；4級，植株嚴重萎蔫，倒伏枯死或不出苗（爛種）。

1.2.2 成株期抗性鑒定 于每年3月中旬播種，待黃瓜苗長至兩葉一心時，移栽到甘肅省農業(yè)科學院蔬菜研究所多年重茬、枯萎病多發(fā)的塑料大棚中自然誘病。鑒定圃人工開畦，四周設寬1 m的保護區(qū)，畦寬60cm，溝寬60cm，畦長3.3 m，3次重復，隨機區(qū)組排列，小區(qū)面積4 m2，每小區(qū)24株。生育期對黃瓜的性型、瓜皮色、瓜形、瓜刺色、瓜瘤大小、瓜刺瘤稀密進行調查，性型分為強雌和雌雄，瓜皮色分為綠、淺綠、白綠，瓜形分為短圓筒、短棒，瓜刺色均為白色，瓜瘤大小分為無、中、大，瓜刺瘤稀密分為稀、密。于黃瓜拉秧前調查枯萎病的病情指數，每小區(qū)24株全部調查，每株連根拔起，記載發(fā)病嚴重度。分級標準［15］：0級，根、莖、葉生長正常；1級，1/4以下根、莖變黃，植株稍有矮化；2級，1/4～1/2根、莖變黃，下部葉脈褪色；3級，1/2～3/4根、莖變黃，莖基縱裂；4級，3/4以上根、莖變黃或直接枯萎死亡。

1.2.3 病情指數計算公式

病情指數=Σ（病情嚴重程度×株數）/（最高病情嚴重程度×調查總株數）×100

1.2.4 抗性評價標準 抗性評價標準［16］：高抗（HR），0＜DI≤10；抗病（R），10＜DI≤30；中抗（MR），30＜DI≤50；感?。⊿），50＜DI≤70；高感（HS），DI＞70。

2 結果與分析

2.1 黃瓜種質對枯萎病的抗性反應

評價結果（表1）表明，供試黃瓜種質對枯萎病的抗性存在差異，對照“迷你1號”表現為抗病，而“津研2號”表現為高感。在33份黃瓜種質中，具有高抗枯萎病的種質3份，占9.09%，抗病種質11份，占33.33%，中抗種質7份，占21.21%，感病種質10份，占30.30%，高感種質2份，占6.06%。

2.2 黃瓜枯萎病抗性分布頻率分析

進一步分析黃瓜種質的抗性分布頻率（表2），結果表明，33份黃瓜種質中，華北型黃瓜3份，均為中抗；歐洲溫室型和歐洲華南雜交型高抗種質所占比例較高，分別為26.00%和16.67%；14份華南型黃瓜，未發(fā)現高抗種質，且感病和高感種質所占比例分別為50.00%、14.29%，均高于歐洲溫室型和歐洲華南雜交型，說明具有歐洲溫室型親緣關系的黃瓜種質較華南型種質抗枯萎病。強雌黃瓜高抗和抗病種質所占比例分別為13.33%和53.33%，均高于雌雄黃瓜；雌雄黃瓜感病和高感種質所占比例分別為38.89%和11.11%，均高于強雌黃瓜，說明強雌黃瓜較雌雄黃瓜抗枯萎病。綠、淺綠和白綠黃瓜中抗以上所占比例依次降低，分別為90.00%、66.67%和50.00%，且綠皮黃瓜高抗種質所占比例為30.00%，23份淺綠和白綠黃瓜的抗性水平均未達到高抗，說明皮色較綠的黃瓜對枯萎病的抗性較強。3份短棒型黃瓜種質，均為中抗；短圓筒黃瓜中抗以上的占比為60.00%，感病和高感種質占比為40.00%。33份黃瓜種質均為白刺，高抗、抗病、中抗、感病、高感種質所占比例分別為9.09%、33.33%、21.21%、30.30%、6.06%。無瘤、中瘤、大瘤黃瓜種質中抗以上所占比例依次降低，分別為75.00%、61.90%、50.00%，且無瘤黃瓜高抗種質所占比例為37.50%，25份中、大瘤黃瓜種質，抗性水平均未達到高抗，說明無瘤黃瓜較中瘤和大瘤黃瓜抗枯萎病。瓜刺瘤稀的種質感病和高感所占比例分別為33.33%和6.67%，均高于瓜刺瘤密的種質，且瓜刺瘤密的種質高抗所占比例為11.11%，高于瓜刺瘤稀的種質，說明瓜刺瘤密的黃瓜種質較刺瘤稀的種質抗病。

表1 不同黃瓜種質資源對枯萎病的抗性

表2 不同生態(tài)類型、性型、瓜條性狀的黃瓜種質資源對枯萎病的抗性

2.3 黃瓜枯萎病抗性遺傳特性分析

由表3可以看出，通過對6份黃瓜自交系配制6份雜交一代的觀察，雜交一代對黃瓜枯萎病的抗性程度取決于雙親抗性的高低。自交系材料的枯萎病病指在7.50～80.83范圍內，雜交一代的病指在13.33～45.67，并且呈現出抗性加強的趨勢。由雜交一代的枯萎病病指可知，雙親自交系只要有1個抗病，雜交一代就表現抗病，其抗病能力介于雙親抗病均值與高抗病親本之間，由此可以說明枯萎病抗性基因是由多基因控制的數量性狀，并且這種性狀可以穩(wěn)定的遺傳給下一代。

表3 親本及雜交1代的病情指數及超中親值比較

3 小結與討論

黃瓜種質對枯萎病的抗性存在差異。在供試的33份黃瓜種質中，具有高抗枯萎病的種質3份，占9.09%；抗病種質11份，占33.33%；中抗種質7份，占21.21%；感病種質10份，占30.30%；高感種質2份，占6.06%。進一步分析黃瓜種質的抗性分布頻率，表明具有歐洲溫室型親緣關系的黃瓜種質較華南型種質抗枯萎病，強雌黃瓜較雌雄黃瓜抗枯萎病，皮色較綠的黃瓜對枯萎病抗性較強，無瘤黃瓜較中、大瘤黃瓜抗枯萎病，瓜刺瘤密的黃瓜種質較刺瘤稀的黃瓜種質抗病。3份短棒型黃瓜種質均為中抗，短圓筒黃瓜中抗以上所占比例為60.00%，感病和高感種質所占比例為40.00%。33份黃瓜種質均為白刺，高抗、抗病、中抗、感病、高感種質所占比例分別為9.09%、33.33%、21.21%、30.30%、6.06%。

目前認為黃瓜枯萎病有4個生理小種，來自美國、以色列和日本的3個菌株分別鑒定命名為生理小種1、2、3號［17］。我國普遍流行的為生理小種4號［18-20］。國內外黃瓜枯萎病苗期抗性鑒定方法主要有菌土法、胚根接種法、灌根法、浸根法和病原菌毒素濾液浸苗法5種，國外以菌土法和灌根法使用最普遍［17，21-22］，國內采用較多的是胚根接種法、浸根接種法、灌根接種法［18，23-25］。菌土接種法較簡單，但病原在基質中的濃度均一性難以掌控。病原菌毒素濾液浸苗法操作繁瑣，灌根接種法效果較差，應用較少。浸根接種法效果較好，但接種較繁瑣，接種拔苗時容易傷根，試驗結果難以排除傷根造成萎蔫的可能。而胚根接種法具有操作簡便，試驗時間短，病害癥狀明顯易調查，結果可靠的特點，所以本試驗采用胚根接種法。本試驗成株期抗性鑒定在甘肅省農業(yè)科學院蔬菜研究所多年重茬、枯萎病多發(fā)的塑料大棚中進行，該地區(qū)屬于枯萎病常發(fā)區(qū)，且枯萎病發(fā)生非常嚴重，說明鑒定結果是可信的。與苗期人工接種相比，通過田間自然感染枯萎病，能客觀反應成株期黃瓜種質對枯萎病的抗性水平。本研究表明，33份黃瓜核心種質，高抗種質僅占5.9%，說明枯萎病高抗種質很少。因此，應不斷收集國內外黃瓜種質資源，持續(xù)鑒定和篩選抗枯萎病的種質資源，為選育抗枯萎病的品種奠定基礎。本研究表明，不同生態(tài)類型、性型、瓜皮色、瓜形、瓜刺色、瓜瘤大小、瓜刺瘤稀密的黃瓜種質對枯萎病的抗性反應不同，因此，在搜集抗枯萎病的黃瓜種質時，可以參考這些性狀進行，可使搜集工作更加有效。

自交系本身的抗病性強弱在很大程度上決定了雜交一代抗性的高低，所以應建立起培育具有強抗病性的雜交一代的高效選擇體系。本研究表明，黃瓜枯萎病抗性為數量性狀遺傳，抗性為顯性基因控制，抗病與感病親本的雜交一代抗病性介于雙親抗性均值與強抗病親本之間，抗病性表現出中親優(yōu)勢，沒有發(fā)現超親優(yōu)勢。但也有研究表明黃瓜枯萎病抗性遺傳有超親優(yōu)勢［26］，這可能與所選材料的不同有關。在生產中應選擇性狀優(yōu)良的抗病性自交系配制雜交一代。其抗病性的強弱往往取決于雙親自交系的來源、區(qū)域差別及抗病性的強弱。

［1］周紅梅，董從娟，張海英，等.黃瓜抗枯萎病基因連鎖分析和定位［J］. 分子植物育種，2015，13（9）：1980-1986.

［2］ALEANDRI M P，CHILOSI G，BRUNI N，et al.Use of nursery potting mixes amended with local Trichoderma strains with multiple complementary mechanisms to control soil-borne diseases［J］.Crop Protection，2015，67：269-278.

［3］喬永旭，張永平，高麗紅.根系邊緣細胞對肉桂酸脅迫下黃瓜和黑籽南瓜活性氧代謝與根系活力的影響［J］. 中國農業(yè)科學，2015，48（8）：1579-1587.

［4］石延霞，徐玉芳，謝學文，等.氟唑活化酯對黃瓜抗枯萎病的誘導作用［J］.中國農業(yè)科學，2015，48（19）：3848-3856.

［5］ZHAO S，DU C M，TIAN C Y.Suppression of Fusarium oxysporum and induced resistance of plants involved in the biocontrol of cucumber Fusarium wilt by Streptomyces bikiniensis HD-087［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2012， 28（9）：2919-2927.

［6］ZHANG F，ZHU Z，YANG X，et al.Trichoder maharzianum T-E5 significantly affects cucumber root exudates and fungal community in the cucumber rhizosphere［J］.Applied Soil Ecology，2013，72：41-48．

［7］ZHANG S P，MIAO H，YANG Y H.A major quantitative trait locus conferring resistance to fusarium wilt was detected in cucumber by using recombinant inbredlines［J］.Molecular Breeding，2014，34：1805-1815.

［8］VAKALOUNAKIS D J，CHALKIAS J.Survival of Fusarium oxysporum f.sp.Radiciscu cumerinum in soil［J］.Crop Protection，2004，23（9）：871-873.

［9］WU H S，ZHOU X D，SHI X，et al.In vitro responses of Fusarium oxysporum f.sp.Niveum to phenolic acids in decaying watermelon tissues［J］.Phytochemistry Letters，2014，8：171-178.

［10］NELSON H E.Multiple factors control the level of resistance induced in tomato by Fusarium oxysporum f.sp.Cucumerinum［J］.Bio.Control，2014，59（5）：625-633.

［11］BONANOM I G，ANTIGNANI V，CAPODILUPO M，et al.Identifying the characteristics of organic soil amendments that suppress soilborne plant diseases［J］.Soil Biology&Biochemistry，2010，42（2）：136-144.

［12］黃仲生，楊玉菇.黃瓜枯萎病病原菌鑒定及防治［J］.華北農學報，1990，5（4）：99-104.

［13］毛愛軍，張 峰，張麗蓉，等，不同黃瓜材料對枯萎病的抗性評價［J］. 華北農學報，2008，23（2）：214-216.

［14］翁祖信，徐新波，馮東昕.黃瓜枯萎病生理小種研究初報［J］. 中國蔬菜，1989（1）：19-21.

［15］方中達.植病研究方法［M］.北京：中國農業(yè)出版社，1998.

［16］李樹德，方智遠，李明遠.中國主要蔬菜抗病育種進展［M］.北京：科學出版社，1995：420-421；439-444.

［17］ARMSTRONG G M，ARMSTRONG J K，NETZER D.Pathogenic races of the cucumber-wilt.Fusarium［J］.Plant Disease Report，1978（62）：824-828.

［18］翁祖信，蔣興祥，肖小文.黃瓜枯萎病抗病性鑒定方法研究-胚根接種法［J］. 中國蔬菜，1985（2）：30-33.

［19］黃仲生，楊玉茹，朱曉丹.中國黃瓜枯萎病菌生理小種鑒定及防治［J］. 華北農學報，1994，9（4）：81-86.

［20］侯安福，尹 彥.黃瓜枯萎病抗性遺傳規(guī)律的研究.中國主要蔬菜抗病育種進展［M］.北京：科學出版社，1995：439-444．

［21］OWEN J H.Fusarium wilt of cucumber［J］.Phytopathology，1955（45）：435-439.

［22］OWEN J H.Cucumber wilt， caused by Fusarium oxysporum f.cucumerinum N F［J］.Phytopathology， 1956（46）：153-157.

［23］周紅梅，毛愛軍，張麗蓉，等.黃瓜枯萎病接種方法及抗性遺傳的研究［J］.華北農學報，2010，25（4）：186-190.

［24］陳風春.黃瓜枯萎病接種方法及抗性遺傳規(guī)律研究［J］. 現代農業(yè)科技， 2014（18）：142-146.

［25］司龍亭，劉洪雨，李 新.黃瓜品種對枯萎病抗性鑒定研究［J］.農業(yè)科技與裝備，2008（1）：10-16.

［26］劉殿林，楊瑞環(huán)，哈玉潔.黃瓜抗枯萎病遺傳特性的研究［J］. 天津農業(yè)科學， 2003，9（2）：33-35.