王紅英 錢春桃 張永兵 伊鴻平 郭勤衛(wèi) 劉佳 吳明珠 陳勁楓

摘要：對不同抗性甜瓜接種蔓枯病菌后測定葉片中葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白含量和3種防御酶(PPO、PO、PAL)的活性。結(jié)果表明：葉綠素含量在接種后呈現(xiàn)先增加后減小趨勢，抗病甜瓜增幅大。葉綠素含量高于感病甜瓜；可溶性糖含量在接種后先降低后升高、再降低再升高，抗病甜瓜可溶性糖含量高于感病甜瓜：可溶性蛋白含量在接種后逐漸升高，感病甜瓜峰值出現(xiàn)早于抗病甜瓜；3種酶活性在接種后都有不同程度提高。其中抗病甜瓜酶活性增幅高于感病甜瓜。幾種酶活性變化可以用于甜瓜蔓枯病抗性鑒定。

關(guān)鍵詞：甜瓜；蔓枯病菌；葉綠素；可溶性糖；可溶性蛋白；PPO；PO；PAL

甜瓜(Cucumis melo L.)蔓枯病是由Didymellabroniae(Auersw.)Rehm引起的一種真菌性病害，其發(fā)生常會導(dǎo)致毀滅性的后果。植物在受到病原菌侵入后，葉片組織會因病原菌侵入發(fā)生一系列變化。據(jù)報道。葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白含量和防御酶多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(PO)及苯丙氨酸解氨酶(PAL)與黃瓜霜霉病、黃瓜白粉病、西瓜枯萎病等多種病害的抗性有關(guān)。然而在不同抗病體系中，植物的抗病機(jī)制表現(xiàn)不盡相同，有關(guān)不同抗性甜瓜接種蔓枯病菌后的影響還未見報道。因此，筆者選取抗病和感病甜瓜材料。對其接種蔓枯病菌后測定分析葉片中一些生理指標(biāo)和幾種保護(hù)酶活性的變化，以進(jìn)一步探討這些指標(biāo)與甜瓜蔓枯病抗性之間的關(guān)系。

1材料與方法

1.1材料

供試材料伊麗莎白為感病甜瓜(S)，由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心提供；PI 420145為抗病甜瓜(R)，由美國康乃爾大學(xué)Molly John教授提供。抗、感病材料均經(jīng)過課題組多代自交和蔓枯病抗性鑒定。供試蔓枯病菌為本實(shí)驗(yàn)室分離純化并保存的A型菌株，該菌株的分生孢子在僅含磷酸二氫氨的馬鈴薯平板培養(yǎng)基上，經(jīng)7 d暗培養(yǎng)和4 d間歇紫外燈(12 h紫外燈/12 h黑暗)處理的光照條件下產(chǎn)生。

1.2抗性鑒定

抗性鑒定試驗(yàn)于2010年秋季在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站塑料大棚內(nèi)進(jìn)行，抗、感材料各60株，30株接種鑒定，30株用清水噴施作為對照，3次重復(fù)。接種鑒定參照Zhang等的方法進(jìn)行，在甜瓜植株長到3-4片真葉時，選取長勢一致的植株對葉部和莖部同時噴施接種，蔓枯病菌孢子懸浮液體積濃度為1×10⁵個·mL^-1。接種后覆蓋棚膜保濕3 d，溫度控制在25℃左右，于接種后第7天統(tǒng)計發(fā)病情況，病情嚴(yán)重程度分級標(biāo)準(zhǔn)為：

莖部：1級，無傷害；2級，單個病斑長1-10mm，或者多個病斑總長1-20 mm但未環(huán)莖1周；3級，病斑21-80mm，或是環(huán)莖1周；4級，莖蔓萎蔫；5級，植株死亡。1-2級為抗病，3-5級為感病。

葉部：1級，侵染面積為0；2級，侵染面積≤25％；3級，25％<侵染面積≤50％；4級，50％<侵染面積≤75％；5級，侵染面積>75％。1-2級為抗病，3-5級為感病。

1.3取樣方法

接種處理前取樣1次，接種后每天取樣1次，取8 d，共取9次(每次均取相同部位功能葉)，用于各生理指標(biāo)測定，測定結(jié)果取3次重復(fù)平均值。

1.4生理指標(biāo)測定

參照沈偉其的方法測定葉綠素含量(略有改動)：植物葉片約4g，于液氮中研磨，然后加入在65℃水浴中預(yù)熱提取緩沖液約900μL，并振蕩搖勻，再加入巰基乙醇約20μL，65℃水浴30min；加入5mol·L^-1KAC 300μL，冰浴30-60 min，12000轉(zhuǎn)·min^-1，離心10min：清液加入1/5體積的5％CTABBuffer上下顛倒充分搖勻，65℃水浴20min；待冷卻至室溫后，加入等體積的氯仿/異戊醇(24：1)抽提2次，室溫11000轉(zhuǎn)·min^-1，離心5min；如界面渾濁，再抽提1-2次；取上清液，加入2/3體積的異丙醇，上下顛倒充分搖勻，室溫放置10min，12000轉(zhuǎn)，min^-1，離心10min；棄上清液，用70％乙醇洗滌沉淀2次，抽干沉淀，加TE溶解。加1/10體積的Rnase(約40μL，10mg·mL^-1)處理DNA樣品，37℃，30min；加入等體積的氯仿，異戊醇(24：1)抽提2次，吸上清液加110體積的3mol·L^-1NaAc(pH值5.2)，2倍體積的無水乙醇搖勻，-20℃放置10 min；4℃，6000轉(zhuǎn)·min^-1離心5min，用70％乙醇洗滌沉淀2次，抽干沉淀，加適量TE Buffer溶解，取2μL與0.8％瓊脂糖凝膠中。100 V電泳30 min。其余-20℃保存。用蒽酮法測定可溶性糖含量。用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定可溶性蛋白含量。PPO和PO液提取參照譚興杰等的方法。PAL液提取參照秦鑫等所采用的方法。

2結(jié)果與分析

2.1甜瓜接菌后葉綠素含量變化

圖1顯示，接種前抗病甜瓜葉綠素含量高于感病甜瓜。接種后抗、感病甜瓜葉綠素含量開始均呈增加趨勢，抗病甜瓜增幅大于感病甜瓜：抗病甜瓜和感病甜瓜第1個峰值均出現(xiàn)在接種后第2天，達(dá)到峰值后均呈現(xiàn)不同程度的下降，并分別在接種后第6天和第5天出現(xiàn)第2個峰值。之后抗病甜瓜和感病甜瓜葉綠素含量繼續(xù)下降，至第8天時葉綠素含量均低于對照，但抗病甜瓜葉綠素含量一直高于感病甜瓜?？?、感病甜瓜對照葉綠素含量均有小幅度下降。

2.2甜瓜接菌后可溶性糖含量變化

圖2顯示，接種前抗病甜瓜可溶性糖含量高于感病甜瓜。接種后，抗、感病甜瓜可溶性糖含量變化趨于一致，即下降、升高、再下降、再升高，均在第8天升到最高點(diǎn)?？共√鸸辖臃N后可溶性糖含量出現(xiàn)大幅度下降，第3天降到最低點(diǎn)，接種后第5天開始再次出現(xiàn)大幅度下降：感病甜瓜接種后可溶性糖含量第1天下降，隨后上升，第3天開始出現(xiàn)較大幅度的下降，第5天降至最低點(diǎn)，隨后開始上升，第7天快速上升。不同抗性甜瓜在不同時期可溶性糖含量變化不同：接種初期，抗病甜瓜可溶性糖含量下降幅度較大，后期上升幅度也較大：感病甜瓜變化幅度不大，且可溶性糖含量均低于抗病甜瓜?？埂⒏胁φ仗鸸峡扇苄蕴呛炕咎幱诜€(wěn)定不變的狀態(tài)。

2.3甜瓜接茵后可溶性蛋白含量變化

圖3顯示，接種前，抗病甜瓜可溶性蛋白含量高于感病甜瓜。接種后，抗、感病甜瓜可溶性蛋白含量均增加，且變化趨勢大體相同，先緩慢升高、再快速升高、再下降。但不同抗性甜瓜可溶性蛋白含量具體變化又不同：抗病甜瓜可溶性蛋白含量緩慢上升，峰值出現(xiàn)在接種后第3天。而后降幅相對平緩，第6天降幅增大后再平緩；感病甜瓜上升很快，峰值出現(xiàn)在接種后第2天，而后快速下降至第4天趨于平緩，最后抗、感病甜瓜均逐漸降低至正常水平。除第2

天感病甜瓜可溶性蛋白含量略高于抗病甜瓜外，其余均明顯低于抗病甜瓜?？?、感病甜瓜接種后第8天可溶性蛋白含量接近對照?？埂⒏胁φ湛扇苄缘鞍缀炕緵]有變化。

2.4甜瓜接菌后3種防御酶活性變化

2.4.1 PPO活性變化圖4顯示，接種前，抗病甜瓜PPO活性顯著高于感病甜瓜。接種后，抗、感病甜瓜PPO活性都有不同程度提高。均在第6天達(dá)到峰值，抗病甜瓜的增幅及峰值顯著大于感病甜瓜，之后均有不同程度的下降，但都明顯高于對照?？共√鸸螾PO活性一直高于感病甜瓜?？?、感病對照甜瓜PPO活性基本沒有變化。

2.4.2 PO 活性變化 圖5顯示，接種前，抗、感病甜的PO活性略高于感病甜瓜。接種后，抗、感病甜瓜第1、2天PO活性增幅不明顯，第3、4天出現(xiàn)大幅度的增加，隨后上升幅度基本趨于平穩(wěn)：感病甜瓜PO活性變化趨勢與抗病甜瓜基本相同，但上升幅度

略低于抗病甜瓜。接種前后抗病甜瓜PO活性均高于感病甜瓜。從接種后第4天開始，抗、感病甜瓜PO活性顯著高于對照，抗、感病對照的PO活性基本無變化。

2.4.3 PAL 活性變化 圖6顯示，接種前?？共√鸸螾AL活性高于感病甜瓜。接種后，抗、感病甜瓜PAL活性均呈上升趨勢，均在第4天達(dá)到峰值，隨后逐漸下降趨于正常：接種后第8天抗病甜瓜PAL活性略高于對照，感病甜瓜與對照趨于一致。感病甜瓜PAL活性相對穩(wěn)定，抗病甜瓜接種前后PAL活性均高于感病甜瓜。抗、感病對照PAL活性變化不大。

3討論

在本研究中抗病甜瓜葉綠素含量一直高于感病甜瓜，暗示葉綠素含量與蔓枯病抗性存在一定程度的正相關(guān)。接種后，抗病甜瓜可以進(jìn)一步合成葉綠素促進(jìn)光合作用和營養(yǎng)物質(zhì)的合成，增強(qiáng)了植物的抗病性。接種前抗病甜瓜可溶性糖含量高于感病甜瓜。接種后抗、感病甜瓜可溶性糖含量變化基本一致，糖含量的變化與抗性沒有明顯的關(guān)系。然而劉慶元等對黃瓜霜霉病的研究認(rèn)為黃瓜葉內(nèi)可溶性糖含量越高，其抗病性越強(qiáng)，否則就越弱。劉素萍等認(rèn)為糖是病原菌生長繁殖必須的營養(yǎng)物質(zhì)，糖含量越高是促進(jìn)植物感病的一個重要因素，本試驗(yàn)結(jié)果與其報道不相符。糖含量的高低在不同品種間與抗性的關(guān)系是不完全相同的。接種前抗病甜瓜可溶性蛋白含量高于感病甜瓜，接種后感病甜瓜峰值出現(xiàn)早于抗病甜瓜，說明感病甜瓜比抗病甜瓜對病原菌的侵入更為敏感，抗病性與植物對病原菌侵染的反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)。

本研究結(jié)果表明。接種后甜瓜PPO、PO和PAL活性顯著提高，抗病品種酶活性升高的相對幅度大于感病品種，說明抗病品種的抗性與酚類代謝物質(zhì)代謝活性相關(guān)，酚類物質(zhì)的分泌能夠增加植物的抗性，次生代謝酶活性增強(qiáng)是甜瓜抗病性的重要生化機(jī)制。PPO、PO和PAL對蔓枯病病原菌的侵染具有積極作用，根據(jù)其是否接種蔓枯病菌的變化規(guī)律，可以為甜瓜蔓枯病的接種鑒定提供參考。

4結(jié)論

本研究結(jié)果表明，甜瓜植株在受蔓枯病菌侵染后，抗、感病材料葉片中的葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白含量較對照均發(fā)生了明顯的變化，抗病材料的PPO、PO及PAL活性均高于感病材料。這些酶活性的變化與甜瓜蔓枯病抗性有密切關(guān)系。