劉振興，梁金龍，楊雪峰，謝 銘（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，貴州遵義563003）

結(jié)直腸癌（CRC）又稱大腸癌，是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居我國消化系統(tǒng)惡性腫瘤的第1位[1]。近年來，隨著人口老齡化、飲食習慣及生活方式的改變，CRC的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[2]。其早期癥狀隱匿、臨床發(fā)現(xiàn)多屬于中晚期、5年生存率低、預(yù)后較差，嚴重威脅著人類的健康[3]。因此，開展CRC的防治研究具有重要意義。CRC的發(fā)生與發(fā)展是一個極為復(fù)雜的過程，為了探討凋亡抑制蛋白（Survivin）、環(huán)氧合酶?2（COX?2）和 P?糖蛋白（P?gp）在 CRC 發(fā)病過程中的作用，本研究采用免疫組化方法檢測Survivin、COX?2和P?gp在CRC中的表達，并分析其相關(guān)性及與臨床病理特征的關(guān)系，從而為探索CRC新的診斷及防治方法提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1—12月本院60例臨床病理資料完整的CRC患者手術(shù)標本，取癌組織和其中20例患者的相應(yīng)正常黏膜組織（距腫瘤大于10 cm）作為研究對象。60例患者中，男31例，女29例；年齡37～80歲，平均（60.2±12.5）歲；所有患者術(shù)前均未進行過放化療等相關(guān)治療，并排除CRC家族史和CRC術(shù)后復(fù)發(fā)者。60例患者均為腺癌，其中腫瘤直徑小于5 cm 34例，≥5 cm 26例；中高分化14例，低分化46例；腫瘤浸潤未及漿膜層19例，浸潤超過漿膜層41例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例；CRC TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期27例，Ⅲ～Ⅳ期33例。所有標本均經(jīng)甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。

1.2 方法

1.2.1 試劑與方法 Survivin兔抗人多克隆抗體、COX?2兔抗人多克隆抗體、P?gp兔抗人單克隆抗體、即用型抗鼠/兔通用免疫組化試劑盒均購自上海基因科技有限公司。采用免疫組化方法（GTVision法）檢測，實驗操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照。

1.2.2 結(jié)果判斷標準 根據(jù)陽性細胞數(shù)及陽性信號出現(xiàn)的位置綜合判斷。Survivin、COX?2陽性染色定位于細胞漿和胞膜的棕黃色顆粒，P?gp陽性染色定位于細胞膜的棕黃色顆粒。細胞著色強度評分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞百分數(shù)（以 a表示）評分：0為 0分，0＜a≤25% 為 1分，25%＜a≤50% 為 2 分，50%＜a≤75% 為 3 分，75%＜a≤100%為4分；以陽性細胞數(shù)計分和著色強弱計分之乘積評定，＞3分者為陽性，≤3分者為陰性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進行分析。計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗；二者的相關(guān)性采用 Spearman相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Survivin、COX?2和 P?gp在 CRC 及正常結(jié)直腸黏膜組織的表達情況 Survivin、COX?2在CRC內(nèi)主要表達于細胞質(zhì)和細胞膜，P?gp主要表達于細胞膜。陽性表達結(jié)果為棕黃色顆粒（圖1～3）。60例CRC組織中Sur?vivin蛋白表達陽性43例，表達率為71.7%（43/60）；20例正常大腸黏膜組織內(nèi)Survivin蛋白陽性表達率為15.0%（3/20），二者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=18.287，P＜0.01）；60例 CRC 組織中 COX?2蛋白表達陽性40例，表達率為66.7%（40/60）；20例正常結(jié)直腸黏膜組織內(nèi)COX?2蛋白陽性表達率為20.0%（4/20），二者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.119，P＜0.01）；60 例CRC組織中P?gp蛋白表達陽性15例，表達率為25.0%（15/60）；20例正常結(jié)直腸黏膜組織內(nèi)P?gp蛋白陽性表達率為10.0%（2/20），二者比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.017，P＞0.05）。見表 1。

圖1 Survivin在CRC及正常結(jié)直腸黏膜組織內(nèi)表達（400×）

圖2 COX?2在CRC及正常結(jié)直腸黏膜組織內(nèi)表達（400×）

圖3 P?gp在CRC及正常結(jié)直腸黏膜組織內(nèi)表達（400×）

表1 CRC、正常結(jié)直腸黏膜組織中Survivin、COX?2和 P?gp 的表達[n（%）]

2.2 Survivin和COX?2的表達與CRC臨床病理特征的關(guān)系 Survivin和COX?2二者均與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期相關(guān)（P＜0.05），而與CRC患者性別、年齡、腫瘤大小及分化程度無相關(guān)性（P＞0.05）。見表2。

2.3 Survivin和COX?2在CRC中表達的相關(guān)性分析 43例Survivin蛋白陽性表達的CRC患者中COX?2蛋白的陽性表達為34例，17例Survivin蛋白陰性表達的CRC患者中COX?2蛋白的陽性表達6例，Spearman相關(guān)性分析顯示二者呈正相關(guān)（r=0.418，P＜0.01）。見表3。

表2 Survivin和COX?2異常表達與CRC臨床病理特征的關(guān)系（n）

表3 CRC患者Survivin和COX?2表達的關(guān)系[n（%）]

2 討 論

CRC是我國最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類健康，其發(fā)生是一個多因素、多步驟共同參與的復(fù)雜過程，而腫瘤患者的預(yù)后與其侵襲、轉(zhuǎn)移及對化療藥物的敏感性密切相關(guān)[4]。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族（IAPs）的一員，也是目前發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子[5]，含142個氨基酸，相對分子質(zhì)量為16.5×103。Survivin具有腫瘤特異性表達的特點，其通過抑制Caspase?3和Caspase?7的活性，從而抑制腫瘤細胞凋亡[6]，促進細胞增殖，并通過對細胞G2/M期的調(diào)節(jié)，參與細胞周期調(diào)控、有絲分裂的過程，導(dǎo)致腫瘤細胞跳過細胞控制點而繼續(xù)增殖[7]。同時其具有促進腫瘤血管生成作用，參與腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為[8]。研究報道，Survivin在正常結(jié)直腸黏膜中呈無表達或低表達，在CRC組織中呈高表達，且與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)[9?10]。本研究結(jié)果顯示，CRC組織中Survivin蛋白表達陽性表達率為71.7%（43/60），明顯高于正常黏膜組織內(nèi)表達陽性表達率15.0%（3/20），二者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=18.287，P＜0.01），其高表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān)（P＜0.05）。提示Survivin可能為CRC特異性表達的一種分子生物學(xué)改變，因此可作為CRC早期診斷和評判預(yù)后的指標。

COX是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素（PG）的關(guān)鍵酶，COX?2是其中一個亞型，在正常組織中無表達，其多種實體腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并與其預(yù)后密切相關(guān)[11]。研究表明，COX?2也過表達于CRC中，與腫瘤臨床分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并與基質(zhì)金屬蛋白酶?2（MMP?2）呈協(xié)同效應(yīng)，共同促進CRC的發(fā)生與發(fā)展[12]。COX?2高表達能夠促進PGs的合成，從而抑制腫瘤細胞的凋亡[13]。趙亞玲等[14]研究結(jié)果表明，塞來昔布能夠顯著下調(diào)COX?2蛋白表達水平，從而抑制人紅白血病HEL細胞增殖、遷移。COX?2可能通過促進細胞增殖和抑制細胞凋亡、誘導(dǎo)腫瘤血管形成、逃避生物體內(nèi)細胞免疫監(jiān)視作用等機制發(fā)揮抗凋亡作用[15]。本研究結(jié)果表明，COX?2蛋白在CRC組織中表達陽性表達率為66.7%（40/60），顯著高于正常黏膜組織內(nèi)表達陽性率20.0%（4/20），二者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.119，P＜0.01），與 Survivin 蛋白表達相同，COX?2高表達也與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān)（P＜0.05）。通過進一步分析，COX?2與Survivin在CRC組織中的陽性表達呈正相關(guān)（P＜0.05），提示二者共同促進了CRC的發(fā)生與發(fā)展。

P?gp是由多藥耐藥基因1（MDR1）編碼的跨膜糖蛋白，是一種腺苷三磷酸（ATP）依賴性外輸泵[16]。P?gp和ATP結(jié)合后，利用ATP供能，將化療藥物泵至細胞外，因此腫瘤細胞內(nèi)的藥物蓄積下降，低于殺傷腫瘤細胞的水平，從而導(dǎo)致細胞產(chǎn)生耐藥，這種藥物外排機制稱為經(jīng)典的多藥耐藥（MDR）機制[17]。趙崗等[18]采用Western blotting檢測CRC耐奧沙利鉑細胞HCT116/L、耐阿霉素細胞LoVo/adr及對應(yīng)親本細胞中P?gp蛋白表達情況，結(jié)果顯示在耐藥細胞HCT116/L、LoVo/adr中P?gp高表達，而在親本細胞中未檢測到其表達。在本研究中，CRC組織內(nèi)P?gp蛋白的表達陽性率25.0%（15/60）與正常黏膜組織內(nèi)表達陽性10.0%（2/20）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.017，P＞0.05）。結(jié)合患者病史資料進行分析，由于患者術(shù)前均未進行過放化療等治療，并未產(chǎn)生化療藥物耐藥性，這或許是本實驗中CRC組織內(nèi)P?gp低表達或無表達的主要原因。

綜上所述，本研究通過免疫組化方法，檢測了CRC組織與正常黏膜內(nèi) Survivin、COX?2和 P?gp的表達，結(jié)果顯示在CRC組織內(nèi)Survivin和COX?2明顯高表達，而P?gp低表達或無表達。Survivin和COX?2的異常表達與CRC的侵襲，轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，進一步分析表明二者的表達呈協(xié)同效應(yīng)，提示二者共同促進CRC的發(fā)生與發(fā)展。通過研究其與CRC臨床特征的關(guān)系，可為CRC的診治及判斷預(yù)后提供新的理論依據(jù)。

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