★ 常佳麗 方清影 張變 陳凱云 余瓊芳 彭代銀 王飄飄 陳衛(wèi)東

(1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學藥物代謝研究所 合肥 230012；3.安徽省中醫(yī)藥科學院 合肥 230012；4.安徽道地中藥材品質提升協(xié)同創(chuàng)新中心 合肥 230012)

肝癌作為常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率逐年上升，嚴重威脅人類生命安全[1-2]。因此研發(fā)一種抗癌療效強，毒副作用小的抗癌藥物具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)新藤黃酸(gambogenic acid，GNA)能特異性抑制肝癌細胞HepG2的增殖，誘導其凋亡，具有治療肝癌的潛力[3]。GNA是從中藥藤黃中提取出來的有效成分，具有抗瘤譜廣，毒性較低的特點，有望成為新的抗腫瘤藥物[4]。

但是GNA水溶性差，體內消除快，半衰期非常短，血管刺激性大，從而制約了GNA的開發(fā)和臨床應用[5]。泡囊是由非離子表面活性劑在水性介質中形成的單層或多層雙分子結構的藥物載體，既可以包裹親水性藥物，又可以包裹疏水性藥物。其具有安全、穩(wěn)定，可減小藥物副作用，提高藥物在體內循環(huán)時間，改善藥物生物利用度，表面可以進行修飾等優(yōu)點，已在多種藥物載體得到應用[6]。而近年來，靶向制劑掀起一股熱潮，引起了廣泛關注。葉酸受體(Folate recptor，F(xiàn)R)[7]是一種糖基化磷脂肌醇連接的膜糖蛋白，在腫瘤細胞表面高度表達并有較高的活性，在正常組織表達很少。同時葉酸( folic acid，F(xiàn)A)[8]無毒，穩(wěn)定，免疫原性低，與葉酸受體有高度親和性，故利用葉酸配體-受體特異性結合來靶向輸送藥物，可以特異性治療惡性腫瘤。本課題組為改善GNA缺陷，提高抗腫瘤作用，將其制備成泡囊并用葉酸進行修飾，且在前期已成功制備，做了相關表征，包封率在80%以上，載藥量10%左右，粒徑在180nm左右，形態(tài)觀察大小均一圓整，均符合藥用要求。故本實驗在課題組前期基礎上繼續(xù)相關研究，本文以人肝癌HepG2細胞為研究對象，探索葉酸修飾新藤黃酸泡囊對HepG2細胞的增殖抑制作用及凋亡作用。

1 材料

1.1 藥物及試劑 新藤黃酸(黃色干燥粉末，純度>99.0%，由安徽中醫(yī)藥大學新藤黃酸課題組提供)；FA-GNA-NISVs、GNA-NISVs(實驗室自制)；RPMI1640培養(yǎng)液(江蘇凱基生物公司)；MTT(美國Sigma公司)；二甲亞砜(天津灝洋生物公司產品)；胰蛋白酶(美國Sigma公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(上海BestBio-貝博生物)；PBS(pH7.2～7.4)(實驗室自制)；其他試劑均為分析純。

1.2 細胞 人肝癌細胞株HepG2來于中國科學院上海細胞所。

1.3 儀器 ELX800uv酶標儀(Bio-TEK公司);ES-315高壓滅菌鍋(日本Tomy KOQYO公司);干燥箱(SHANGHAI BOXUN);371型CO2培養(yǎng)箱(Germany);BHC-1300IIA/B2超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司);FACS Calibur流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司);光學倒置顯微鏡(上海長方光學儀器有限公司);AB135-S 電子分析天平(德國METTLER TOLEDO公司);TDL-5離心機(德國EPPENDORF公司);75cm2培養(yǎng)瓶(美國Corning公司);96及6孔培養(yǎng)板(美國Corning公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)和傳代 接種HepG2 細胞于培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，相對飽和濕度的條件下生長，每天觀察細胞生長狀況，待細胞貼壁生長至80%～90%的密度時，胰酶消化后傳代，周期為2-3天。

2.2 對HepG2 細胞的增殖抑制作用 取對數(shù)生長期的HepG2 細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，加入培養(yǎng)基終止消化，1000rpm離心5min，稀釋一定倍數(shù)制成細胞懸液，按5×104個/cm2密度將細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h貼壁后，分別加入不同質量濃度的GNA溶液，GNA-NISVs溶液和FA-GNA-NISVs溶液各100μL(配藥時用不完全培養(yǎng)基)，使其最終濃度為0.2,1,4,6,8,10,16μg/mL，空白制劑組各濃度按FA-GNA-NISVs組同等稀釋，各實驗組設6個復孔，另設不含藥物孔作藥物組陰性對照，培養(yǎng)基(無細胞)作調零孔。24h后每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)3.5～4.0h，棄去上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)150μL，振蕩15min，待藍色結晶完全溶解后，用酶標儀在波長490nm處測量吸光度。然后計算藥物對細胞的抑制率。抑制率IR%=(陰性對照組OD值-實驗組OD值)/陰性組OD值×100%。

2.3 對HepG2 細胞形態(tài)的影響 0.25%胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的細胞，離心，配成細胞懸液后接種于6孔細胞培養(yǎng)板中(5×104)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，至細胞貼壁生長成單層后加入培養(yǎng)基稀釋的GNA、FA-GNA-NISVs與GNA-NISVs，終濃度均為8μmol/L。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h后，倒置顯微鏡下觀察，并拍攝照片。

2.4 對HepG2 細胞凋亡實驗 HepG2 細胞以細胞數(shù)為2×105個細胞接種于六孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞完全貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，PBS清洗兩遍。分別加入培養(yǎng)基稀釋的GNA、GNA-NISVs、FA-GNA-NISVs(濃度分別為4μg/mL，8μg/mL)作為給藥組，另設空白對照組(不含藥物)，平行3組。在37℃、5%CO2條件下繼續(xù)孵育24h，收集原含藥培養(yǎng)液，PBS洗兩遍，收集，加入0.5mL不含EDTA的胰蛋白酶消化細胞，待消化完全，加入培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻，轉入離心管內2000rpm離心5min，棄去上清。加入預冷的PBS混懸，離心棄去上清，重復兩次，收集細胞，用0.5mL的結合緩沖液重懸細胞，轉入1.5mL EP管中，加入5μL的Annexin-V/FITC冰浴下避光孵育15min，再加入10μL的PI染色，充分混勻，繼續(xù)孵育5min，最后轉入流式管內，上流式細胞分析儀檢測。

3 結果

3.1 對HepG2 細胞的增殖抑制作用 MTT試驗表明，GNA對HepG2細胞有明顯的抑制效應，表現(xiàn)出較強的細胞毒性，且呈劑量依賴性。將GNA制備成泡囊后，對細胞的抑制率有所提高，并有顯著性差異(P<0.05)，而空白載體對細胞幾乎沒有毒性。葉酸修飾組與未修飾組相比，葉酸修飾后的新藤黃酸泡囊顯著抑制了HepG2細胞的增殖，且與另外兩組比較差異有顯著性意義(P<0.05)。詳細見圖1(GraphpPad Prism6.02擬合)。經SPSS17.0擬合IC50得出FA-GNA-NISVs的IC50值為1.701μg/mL，分別是GNA-NISVs和GNA Solution的1/3、1/5左右，見表1。再一次證明葉酸修飾的新藤黃酸非離子表面活性劑泡囊，增加了對腫瘤細胞的抑制效應，具有明顯的受體靶向作用和細胞殺傷性。

3.2 對HepG2 細胞形態(tài)的影響 倒置顯微鏡下觀察細胞(見圖2)，可明顯看出，空白組細胞貼壁生長良好，呈梭形或不規(guī)則形，給藥組細胞多呈現(xiàn)變圓固縮狀態(tài)，透亮度變差，且有大量死細胞漂浮，出現(xiàn)明顯的凋亡趨勢。給予相同濃度的不同實驗組顯示出，原料藥組細胞變圓不明顯，而FA-GNA-NISVs處理過的細胞凋亡趨勢較為顯著，活細胞數(shù)量明顯較少,且倒置顯微鏡下觀察漂浮有大量死細胞。

注：與GNA游離藥組比較，#P<0.05；與GNA-NISVs組比較，*P<0.05。

Formulations IC50/μg·mL-1FA-GNA-NISVs 1.701±0.135*GNA-NISVs 5.089±0.360*GNASolution9.133±0.151

注：與GNA Solution組比較，*P<0.05。

1.空白對照組；2.新藤黃酸游離藥8μg/mL；3.非葉酸修飾新藤黃酸泡囊8μg/mL；4.葉酸修飾新藤黃酸泡囊8μg/mL；

3.3 對HepG2 細胞凋亡實驗 正常細胞和早期凋亡的細胞膜是完整的，Propidium iodide (PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡晚期的細胞和壞死細胞，PI能透過細胞膜和細胞核結合而呈現(xiàn)紅色，故將Annexin V與PI匹配使用，可以將凋亡早期的細胞和晚期細胞及壞死細胞區(qū)分開。流式結果顯示，與空白對照組相比，藥物干預24h后，細胞成活率明顯降低。當給予4μg/mL的各組藥物時，F(xiàn)A-GNA-NISVs組顯示了較高的凋亡率，早期凋亡及晚期凋亡都明顯增加，說明葉酸修飾后的GNA泡囊可提高誘導凋亡的能力。相比于4μg/mL藥物組，當濃度增加一倍時，細胞卻呈壞死趨勢，且FA-GNA-NISVs誘導壞死細胞最多。

A.空白對照組；B.新藤黃酸游離藥4μg/mL；C.非葉酸修飾新藤黃酸泡囊4μg/mL；D.葉酸修飾新藤黃酸泡囊4μg/mL；E.空白對照組；F.新藤黃酸游離藥8μg/mL；G.非葉酸修飾新藤黃酸泡囊8μg/mL；H.葉酸修飾新藤黃酸泡囊8μg/mL

4 討論

泡囊是類似于脂質體的新型藥物載體，其成膜材料生物相容性好、易降解、安全無害，用來運載藥物具有選擇性高、緩釋的優(yōu)勢[9]。再利用葉酸配體修飾藥物載體表面，可達到抗癌藥物的主動靶向輸送[10]。葉酸修飾泡囊運載藥物治療癌癥時可運輸藥物到達腫瘤細胞表面，因此可減少藥物的給藥劑量，降低藥物毒副作用，提高藥物抗腫瘤作用。

Fenggen Yan[11]發(fā)現(xiàn)新藤黃酸能抑制HepG2細胞增殖，誘導其凋亡，且凋亡機制與Phospho-Erk1 / 2和Phospho-p38 MAPK在HepG2細胞中的蛋白表達變化有關。課題組研制出葉酸修飾新藤黃酸泡囊新劑型，研究其對HepG2細胞體外藥效。MTT試驗表明FA-GNA-NISVs對肝癌HepG2細胞抑制作用顯著，抑制率也明顯高于其它組，且呈現(xiàn)出良好的量效關系。AnnexinV-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡，在兩個劑量濃度下FA-GNA-NISVs均呈現(xiàn)較高的凋亡率和死亡率，提示藥物抑制細胞增殖主要通過誘導細胞凋亡及壞死導致，表明修飾后的藥物包載小劑量的藥物即可達到抗腫瘤效果。但流式實驗中我們發(fā)現(xiàn)了細胞呈兩種不同形式的細胞死亡狀態(tài)，在低劑量下，細胞主要呈凋亡式死亡，高劑量時，細胞壞死比較明顯。細胞凋亡和壞死一般是細胞死亡的兩種不同形式，且在發(fā)生機制、形態(tài)上、過程和結局上都有著明顯的不同，但兩種在某些狀態(tài)下有一定的相關性，細胞凋亡在一定條件下可轉化為細胞壞死[12]。本文出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由于藥物劑量較大時，激活了誘導細胞壞死的某種程序，從而引發(fā)細胞壞死。

但無論細胞以哪一種狀態(tài)死亡，葉酸修飾組的細胞存活率都明顯低于其它組，顯示出一種優(yōu)良的抗腫瘤療效，增加了對腫瘤細胞的主動靶向的能力。但具體的凋亡及壞死機制尚不明確，本課題后期也將對GNA溶液、GNA-NISVs和FA-GNA-NISVs誘導HepG2細胞凋亡及壞死的具體路徑及機制，對實體腫瘤的抗癌效應等進一步探討。

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