王慶武 喬愛麗 蘭玉菲

（泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東泰安271000）

黑木耳（Auricularia auricular）是我國傳統(tǒng)食用菌[1]，因營養(yǎng)價(jià)值高，而受到消費(fèi)者的青睞，栽培面積不斷擴(kuò)大，生產(chǎn)水平穩(wěn)步提高[2]。傳統(tǒng)的黑木耳栽培所用菌種為固體菌種，每級菌種代代轉(zhuǎn)接，生產(chǎn)周期長，菌齡不整齊[3]，污染率及成本高，生產(chǎn)效率低。而發(fā)酵菌種是用液體培養(yǎng)基，在生物發(fā)酵罐中，通過深層培養(yǎng)（液體發(fā)酵）技術(shù)生產(chǎn)的液體形態(tài)的食用菌菌種，其成本低，菌絲生長快，縮短生產(chǎn)周期[4]，菌種純度高、菌齡一致、萌發(fā)快，解決了固體菌種擴(kuò)大生產(chǎn)中難以同步性生長的問題[5]，縮短養(yǎng)菌時(shí)間，出耳整齊，產(chǎn)業(yè)綜合效益穩(wěn)步提高[6]。因此，黑木耳液體菌種代替?zhèn)鹘y(tǒng)固體菌種愈來愈受到人們的關(guān)注[7]，并逐步應(yīng)用到生產(chǎn)中。為此，筆者重點(diǎn)對黑木耳液體發(fā)酵、菌種制作的環(huán)境條件、儀器設(shè)備、培養(yǎng)基、搖瓶菌種、發(fā)酵菌種、菌齡等進(jìn)行總結(jié)，旨在為黑木耳液體發(fā)酵菌種的制作提供技術(shù)參考。

1 環(huán)境條件

發(fā)酵菌種生產(chǎn)場所應(yīng)遠(yuǎn)離工礦業(yè)的“三廢”及微生物、粉塵、煙塵，至少300 m之內(nèi)無禽畜場舍、屠宰場、垃圾場，無污水和其他污染源；用水應(yīng)符合GB 5749的規(guī)定。生產(chǎn)車間地面應(yīng)防水、防滲漏、防腐、防滑、易清洗，良好的排水系統(tǒng)；墻壁和天花板應(yīng)能防水、防潮、防霉、易清洗；車間入口設(shè)置緩沖間，門窗安裝防蟲紗網(wǎng)。

2 儀器設(shè)備

不銹鋼發(fā)酵罐（包括空氣過濾器，與罐體串聯(lián)為一體）、空氣壓縮機(jī)、配電箱、高壓滅菌鍋、恒溫?fù)u床、超凈工作臺、搖瓶、光學(xué)顯微鏡、酸度計(jì)等。發(fā)酵罐的質(zhì)量應(yīng)該符合GB 150的規(guī)定。

3 液體培養(yǎng)基

①玉米粉40 g∕L，淀粉 30 g∕L，牛肉膏3 g∕L，酵母膏 3 g∕L，磷酸二氫鉀2 g∕L，硫酸鎂 1 g∕L，維生素B15 mg∕L，花生油 0.5 mL∕L，pH 6.0～6.5。②玉米粉30 g∕L，淀粉40 g∕L，麩皮（煮汁）2 g∕L，酵母膏4 g∕L，磷酸二氫鉀3 g∕L，硫酸鎂1.5 g∕L，花生油0.5 mL∕L，pH 6.0～6.5。

4 搖瓶菌種制作

4.1 搖瓶培養(yǎng)基制作

液體培養(yǎng)基任選其一，玉米粉、淀粉先用溫水?dāng)嚢杈鶆?，混合均勻，裝入搖瓶中，裝液量為搖瓶容量的60%～70%，聚丙烯薄膜封口。高壓蒸汽滅菌，121℃、0.11 MPa滅菌40 min，待壓力自然回零后開鍋取瓶。

4.2 接種培養(yǎng)

滅菌后搖瓶培養(yǎng)基冷卻至30℃以下，無菌條件下，挑取5～6塊1～4 mm2經(jīng)活化的母種塊放入搖瓶內(nèi)，封口，避光靜置24 h后置于恒溫?fù)u床上，溫度24～28℃、轉(zhuǎn)速140～160 r∕min，培養(yǎng)7～8 d。

4.3 搖瓶菌種標(biāo)準(zhǔn)

培養(yǎng)液澄清透明不渾濁，無雜菌、無異味；菌絲球（或菌絲片段）均勻懸浮于液體中不分層，直徑不大于2 mm。

5 液體發(fā)酵菌種制作

5.1 滅菌與裝罐

臭氧機(jī)臭氧環(huán)境滅菌40 min，待臭氧耗盡后即可操作。液體培養(yǎng)基任選其一，培養(yǎng)液無結(jié)塊，打開罐蓋，裝入發(fā)酵罐內(nèi)，加清水定容，裝液量為發(fā)酵罐容量的70%～80%。通入空氣攪拌1～2 min，混合均勻，密封蓋口。

5.2 滅菌

發(fā)酵罐加熱層通入冷水，水位低于排水口20 cm，關(guān)閉進(jìn)、排水閥門；高壓蒸汽滅菌，待壓力達(dá)到0.05 MPa時(shí)緩慢打開排氣閥降壓至0，關(guān)閉排氣閥，再次升壓至0.11 MPa，同時(shí)打開空氣過濾系統(tǒng)蒸汽滅菌50 min。

5.3 冷卻

滅菌結(jié)束，緩慢打開空氣過濾系統(tǒng)排水閥門和加熱層進(jìn)水閥，加熱層立即通入冷水降溫，同時(shí)緩慢打開罐體排氣閥降壓。待發(fā)酵罐內(nèi)壓力接近0時(shí)打開空氣壓縮機(jī)，經(jīng)空氣過濾系統(tǒng)向罐體內(nèi)通入無菌空氣，攪拌培養(yǎng)液，調(diào)整罐體排氣閥，維持罐壓正壓。發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液溫度降至30℃以下時(shí)，關(guān)閉進(jìn)水閥門，調(diào)節(jié)排氣閥，維持罐壓0.04～0.05 MPa。

5.4 接種

關(guān)閉罐體進(jìn)氣閥門和空氣壓縮機(jī)，調(diào)節(jié)罐體排氣閥，將罐壓降至0，無菌條件下（接種口用75%酒精擦拭，并用95%酒精灼燒，火焰圈套在接種口上）快速將搖瓶上的膠管插在接種口上，撤掉火焰圈，打開接種口閥門，接入已經(jīng)確認(rèn)無任何污染的搖瓶菌種，接種量1%～2%，關(guān)閉接種口。

5.5 培養(yǎng)

繼續(xù)通入無菌空氣，調(diào)節(jié)罐體排氣閥，維持罐壓0.01～0.03 MPa，培養(yǎng)溫度24～28℃，培養(yǎng)8～10 d。

5.6 質(zhì)量檢測

接種后每間隔2 d，無菌條件下由取樣口取樣50 mL，接種于GB 4789.28規(guī)定的試管斜面或平板培養(yǎng)基上，置于30℃恒溫培養(yǎng)1～2 d，檢測有無雜菌侵染，確定繼續(xù)還是終止培養(yǎng)；取樣于光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲體形態(tài)特點(diǎn)，若發(fā)現(xiàn)異常菌絲體則生長不良，終止培養(yǎng)；取樣測定菌液酸堿度，判斷菌液的優(yōu)劣；也可鼻嗅罐體排氣閥排出的氣體味道，無異味，有培養(yǎng)基料香味及黑木耳特殊的味道可繼續(xù)培養(yǎng)，有酸臭味終止培養(yǎng)。四種檢測方法結(jié)合檢測效果最佳。

5.7 發(fā)酵菌種標(biāo)準(zhǔn)

培養(yǎng)液澄清透明不渾濁、稍黏稠，無雜菌、無異味；菌絲球（或菌絲片段）均勻懸浮于液體中不分層，直徑不大于3.5 mm。

6 菌種貯存

環(huán)境溫度低于20℃，搖瓶菌種可存放3～5 d；發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵菌種，持續(xù)通無菌空氣，保持罐壓0.01～0.03 MPa，可存放2 d左右。