徐雅楠,孫立杰,于麗麗,黃鳳蘭

蓖麻毒蛋白在細胞內的轉運過程研究進展

徐雅楠1,2,孫立杰1,于麗麗1,黃鳳蘭1,2

1. 內蒙古民族大學生命科學學院, 內蒙古 通遼 028000 2. 內蒙古自治區(qū)高校蓖麻產業(yè)工程技術研究中心, 內蒙古 通遼 028000

蓖麻毒蛋白（Ricin）是一種核糖體失活蛋白，對真核細胞有毒性。它移除真核細胞核糖體大亞基28S rRNA保守序列中特異的腺嘌呤殘基，使蛋白合成過程終止，導致細胞死亡。本文對蓖麻毒蛋白在植物細胞內合成后轉運出細胞的過程，以及蓖麻毒蛋白作用于哺乳動物細胞時轉運過程的研究進展予以簡要描述。

蓖麻毒蛋白; 轉運過程; 蓖麻細胞; 哺乳動物細胞

蓖麻毒蛋白（Ricin）是主要存在于蓖麻（）種子中的一種植物糖蛋白，含量占籽重1%~5%。蓖麻作為油料作物，全球廣泛種植。作為蓖麻油產業(yè)的副產物，蓖麻毒蛋白每年產量50000 t[1]。蓖麻毒蛋白是核糖體失活蛋白（Ribosome-inactivating Protein，RIP）家族成員，可使核糖體失活而終止蛋白合成，對真核細胞具有毒害作用。蓖麻毒蛋白對酵母菌的毒性相比于對哺乳動物細胞的毒性較弱，對某些惡性腫瘤細胞毒性更強[2]。這使它在醫(yī)學上成為用于殺傷腫瘤細胞的首選毒素之一。蓖麻毒蛋白屬于B級生物威脅制劑，至今仍無可用疫苗，且因其毒性大、易提取的特點，易為恐怖組織利用成為生物武器。針對其毒性的治療策略相關研究圍繞著酶活性抑制、毒素攝取或運輸的干擾等方面進行。研究蓖麻毒素疫苗或治療手段仍停留在小鼠、靈長類等動物實驗階段[3,4]。蓖麻毒蛋白的毒性既可以成為腫瘤治療的一劑良藥，也可以作為毒藥低劑量致死。所以，為更好的防治并利用蓖麻毒蛋白，它的毒性作用機理成為研究的重點。研究的目的是更深入的理解作用機理，并對疫苗的研發(fā)以及進一步抗癌治療奠定基礎。

1 蓖麻毒蛋白的毒性機制及生物學功能

蓖麻毒蛋白在種子的發(fā)育階段合成并儲存在成熟蓖麻種子的液泡中。蓖麻毒蛋白是一種異二聚體，具有催化活性的A鏈（Ricin toxin A，RTA）和具有細胞識別功能的B鏈（Ricin toxin binding subunit B，RTB）通過二硫鍵連接在一起。

RTA是其活性亞基，分子量約為32 kDa，是267個氨基酸殘基組成的球形糖蛋白，在10和236位天冬氨酸殘基上進行糖基化[5,6]。RTA糖基化不影響其催化能力，而是刺激毒素運出內質網[8]。通過一系列研究發(fā)現，RTA亞基的糖基化以及RTA的C-末端疏水序列有助于其轉運出內質網進入細胞胞液并發(fā)揮毒性。RTA具有糖苷酶活性，可以從真核細胞核糖體大亞基的28S rRNA移除保守序列中特異的腺嘌呤殘基（A4324）[8]，阻止翻譯延伸因子eEF-2結合到核糖體的GTP酶活性中心，加速細胞死亡。在RTA與核糖體相互作用時，需要P1/P2蛋白輔助[9]，與P蛋白的結合是與核糖體相互作用的關鍵步驟[10]。RTA與蓖麻毒蛋白全毒素毒性有很大的差異，RTA因其缺乏RTB影響了進入細胞的效率，所以只有輕微毒性[3]。

RTB是結合亞基，分子量約為34 kDa，是由262個氨基酸殘基組成的啞鈴型蛋白質，有兩個主要的結構域，每個結構域上都含有一個半乳糖結合位點。RTB具有凝集素活性，是半乳糖結合蛋白，能與細胞表面的半乳糖/N-乙酰半乳糖胺殘基結合[11]，通過由受體介導的內吞方式進入細胞。

蓖麻毒蛋白家族有6~8個成員[12,13]。其中兩個主要的成員是蓖麻凝集素II（Ricinus communis agglutinin ll，ricin）和蓖麻凝集素I（Ricinus communis agglutinin l，RCA）。儲存的蛋白在種子萌發(fā)后的幾天內被水解，用以提供種子發(fā)育過程中基因表達產生的編碼蛋白合成所需的氨基酸。種子萌發(fā)后的幾天內，隨著植株光合合成能力的增強，儲備的蛋白質被完全消耗掉，此時的蛋白合成可以通過光合合成來完成。因此，蓖麻毒蛋白的生物學功能一方面是種子的儲存蛋白，同時用以種子自我防御，防止食草動物啃食。

2 蓖麻毒蛋白在植物細胞中合成后的運輸過程

蓖麻的基因組由10條染色體組成。調查結果顯示：基因組中具有28個推定的Ricin基因，包括潛在的假基因和基因片段，但是其中只有一個應答于蓖麻油的生物合成，說明種子產生高毒性蛋白有選擇壓力[14]。

蓖麻毒蛋白在蓖麻細胞內先合成一條含有RTA和RTB序列的多肽鏈前體，這一前體包含576個氨基酸殘基。多肽鏈N-末端的35個氨基酸殘基包含一段26個殘基組成的N-末端信號序列和一段9個殘基組成的前導肽[15]。后面緊跟著267個氨基酸殘基的RTA序列，12個氨基酸殘基組成的連接肽，以及262個殘基組成的RTB序列。12個氨基酸殘基的連接肽包含了引導蓖麻毒蛋白進入液泡的目標序列[16]。

在植物細胞內合成蓖麻毒蛋白的過程中，N-末端信號肽指導初始多肽鏈轉運是通過內質網膜進入到內質網腔，使9個殘基的前肽在N-末端暴露出來。在信號肽被切除后，RTA的N-末端的9個殘基的前肽作為間隔區(qū)影響通過內質網膜的共翻譯轉運和蛋白核心糖基化的效率[17]。內質網腔中新合成的前肽缺少了26個殘基的信號肽，但仍包含N-末端前導肽和12個殘基的連接肽。這種需要剪切-轉位-激活的結構特征對于產生毒素的植物細胞的自我保護非常重要，因為植物細胞本身的核糖體對于RTA的作用也十分敏感。前肽中的RTA部分不具有催化活性，與B鏈的連接抑制了A鏈的催化活性。這種抑制作用是由毒蛋白前肽中RTB通過空間位阻效應妨礙了RTA活性位點的暴露。事實上，這種對于RTA活性位點的抑制作用也存在于RTA:RTB偶聯的成熟的異二聚體中[18]。正是在蓖麻毒蛋白產生和運輸過程中的這種隱藏活性位點的無活性形式阻止了蓖麻細胞內自身核糖體的失活。

蓖麻毒蛋白產生和運輸過程中，在植物細胞內質網膜上的轉運過程伴隨著蛋白前體三次主要的修飾過程。首先，N-末端信號序列（26個氨基酸殘基）被內質網腔信號肽酶剪切（Co-translationally）。然后，蓖麻毒蛋白前體（Proricin）進入內質網腔后被N-糖基化修飾。蓖麻毒蛋白前體有四個N-糖基化位點，兩個位于RTA序列，兩個位于RTB中。最后，蛋白二硫化異構酶催化蛋白內五個二硫鍵的形成。在成熟的蓖麻毒蛋白中，四個二硫鍵在RTB中，另一個二硫鍵連接著RTA和RTB[19]。

蓖麻毒蛋白需要從植物細胞的合成位點通過內質網運輸至液泡中儲存。糖基化的前肽通過運輸泡從內質網通過高爾基體復合物運輸進入液泡。連接的多糖在胞內運輸過程中被修飾結合。12個氨基酸殘基的連接序列還包含了液泡分選信號。到達液泡后，前肽被內肽酶剪切加工去除RTA和RTB之間的12個氨基酸殘基的連接序列以及前肽N-末端的9個氨基酸殘基[20]。液泡加工酶（VPE）負責剪切前肽中C-末端的天冬氨酸殘基。前肽加工終止于天冬氨酸的剪切。這類蛋白水解作用是典型的種子儲存蛋白的成熟過程[21]。RTA和RTB仍然通過一個二硫鍵共價連接，RTA和RTB中間連接序列的剪切是在二硫鍵中間發(fā)生的。

3 蓖麻毒蛋白在哺乳動物細胞中的轉運

蓖麻毒蛋白在植物細胞中是順向運輸，最終進入液泡并形成具有活性的成熟形式。而在作用于哺乳動物細胞時，蓖麻毒蛋白通過RTB亞基與細胞表面的受體結合，通過內吞作用進入哺乳動物細胞，并有一部分釋放自由的RTA并最終輸送到胞液，與核糖體相互作用。逆向運輸通路[22]是從高爾基體反面網絡（Trans-Golgi network，TGN）到內質網的運輸過程。蓖麻毒蛋白就是采用此通路（其他毒素從內質網進入靶細胞胞液）進入內質網腔。就蓖麻毒蛋白而言，現在對于運輸通路中的很多分子細節(jié)還是不清楚的。

3.1 蓖麻毒蛋白進入哺乳動物細胞的內吞過程

蓖麻毒蛋白與其他生物毒素類似，都是通過與細胞表面受體結合而內吞進入細胞內部的。細胞表面的某些成分無意中充當了毒素進入細胞的受體。蓖麻毒蛋白RTB亞基作為一個半乳糖特異性凝集素，潛在的細胞表面靶標是暴露在外的-1，4-半乳糖殘基。這樣的組分在哺乳動物細胞表面數量豐富（例如，Hela細胞含有3×107潛在的結合位點）[23]。

細胞表面結合的蓖麻毒蛋白一部分通過內吞作用進入細胞內部。蓖麻毒蛋白進入細胞后最先出現在早期內吞泡（Early endosomes，EEs）。從早期內吞泡開始，毒蛋白可能有幾種不同的命運。一部分蓖麻毒蛋白從早期內吞泡通過晚期內吞泡進入溶酶體，被酶解降解。一部分蓖麻毒蛋白從早期內吞泡進入回收內吞泡，并返回細胞表面，完成一個無用的進出循環(huán)。小部分蓖麻毒蛋白從早期內吞泡進入到TGN中，這部分是對于細胞毒性的關鍵[24]。在運輸過程中，RTA還必須成功通過內質網的質量控制檢測過程——內質網相關的蛋白降解（ER-associated protein degradation，ERAD），才能最終從內質網腔進入胞液[25]。RTA的泛素化是其被蛋白酶體降解的關鍵特征。多泛素鏈通常添加到賴氨酸殘基上。而從內質網進入到胞液的RTA具有低賴氨酸特征，所以首次提出RTA的低賴氨酸特征是其能夠逃過ERAD檢測從內質網進入胞液的主要原因[26]。實驗證實，額外引入賴氨酸殘基會增加RTA被蛋白酶降解的傾向。

3.2 蓖麻毒蛋白運輸進入內質網的運輸過程

在真核細胞中，內質網是分泌蛋白和細胞器各類膜蛋白的通路入口。新生蛋白通過內質網膜上的Sec61轉位子進入內質網腔[27]。在內質網腔中，這些新合成的蛋白質折疊、成熟并加工依賴于內質網中的分子伴侶和內質網內催化N-糖基化及二硫鍵形成相關的酶。寡聚蛋白從單體成分依次裝配。以上這些過程都受到內質網質控系統(tǒng)（ER quality control，ERQC）的監(jiān)督[28]。新合成的蛋白在通過ERQC后才能進一步在內質網發(fā)揮功能或是通過囊泡轉運出內質網分泌出細胞。而未能正確折疊或是組裝的蛋白質將被ERAD識別并進一步處理掉，因為非正常蛋白在細胞內積累會對細胞產生傷害。那么對于像RTA這樣一個天然的蛋白質如何才能被ERAD識別成為其底物而不運出內質網？答案似乎是RTA在內質網中的部分折疊。RTA的C-末端包含一個疏水性肽段。在全毒素中，這一疏水區(qū)域被RTB所覆蓋。而當RTA從全毒素中被釋放后，這一疏水區(qū)域暴露并與內質網相互作用。以上現象是間接通過RTA與脂質體作用后構象展開證明的[29]。而后，又進一步了解到RTA與內質網膜相互作用是通過與磷脂酰絲氨酸相互作用[30]。提純的RTA也是熱力學不穩(wěn)定的，易于聚集或形成熔球體[31]。以上過程偶聯內質網膜的嵌入過程，使得RTA進一步展開部分構象。推測，這種膜嵌入形式可以模仿一個錯誤折疊的蛋白，可以使RTA以ERAD通路從ER逃離。在脫位前，ERAD底物必須維持可溶形式，這可能是BIP共分子伴侶的需求[32]。還發(fā)現，ERAD特異性的甘露糖苷酶調節(jié)蓖麻毒性[33]。

一旦蓖麻毒蛋白的全毒素進入內質網腔后，RTA必須釋放并以具有潛在催化活性的形式進行反向轉運（ER到細胞胞液）。在內質網的氧化環(huán)境中，RTA和RTB的分離是在二硫鍵異構酶催化下完成的還原反應[34]。RTA運出內質網必須成功逃離ERAD。

3.3 蓖麻毒蛋白在細胞質內的分類過程

泛素化是蛋白酶降解蛋白質的選擇的關鍵特征。泛素鏈常被修飾到賴氨酸殘基側鏈上。蓖麻毒蛋白中RTA低賴氨酸含量這一特征使得一部分RTA有機會逃離泛素降解的命運而發(fā)揮其毒性作用。所以，從這個角度更容易理解蛋白酶體抑制劑可以增加哺乳動物細胞對蓖麻毒蛋白的敏感性這一現象[26]。RTA從內質網運出后從RTP4轉移給相鄰的RPT5亞基。隨后，RTA在RPT5分子伴侶功能以及Hsc70的協(xié)助下恢復其催化活性[35]?，F在，RTA在胞液中失活的機制還不清楚，蛋白酶體不能直接將RTA作為有效底物水解。HOP（Hsc70-Hsp90 operating protein）介導的從Hsc70轉移到Hsp90-CHIP E3復合物可能指導RTA進入蛋白酶體[31]。

4 總結與展望

在蓖麻細胞的合成過程中，蓖麻毒蛋白從內質網，到高爾基體再到液泡采取順向轉運。在蓖麻細胞轉運過程中，要保證蓖麻毒蛋白不與細胞內自身核糖體發(fā)生作用，影響蛋白合成。而當它毒害哺乳動物細胞時，毒蛋白經歷了從細胞表面到內質網的逆向轉運過程，并進一步轉運進入胞液后發(fā)揮其毒性作用。因此，蓖麻毒蛋白從合成后到進入靶細胞發(fā)揮作用這整個過程是個復雜過程，要依賴于毒蛋白的有效合成及運出，也依賴于細胞表面的可用受體，成功進入內質網后，全毒素的分離以及與內質網內分子伴侶的相互作用，并RTA脫位轉運出內質網。在這一系列有趣又不尋常的過程中還隱藏著很多未知的問題有待被發(fā)現。而這些過程的詳細研究解將為蓖麻毒蛋白中毒治療以及其毒性在腫瘤治療中的應用奠定基礎。

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Research Progress of Ricin Transport Process in Cells

XU Ya-nan1,2, SUN Li-jie1, YU Li-li1, HUANG Feng-lan1,2

1./028000,2.028000,

Ricin is a ribosome-inactivating protein (RIP) that is highly toxic to eukaryotic cells. It removes the specific adenine residues from the 28s rRNA conserved sequence of the eukaryotic ribosomal large subunit, thus terminating the process of protein synthesis and leading to cell death. In this paper, the process of ricin synthesized and transported out of plant cells and the progress of ricin transported into mammalian cells are briefly described.

Ricin; transport process; castor cell; mammalian cell

Q71

A

1000-2324(2018)06-0916-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2018.06.002

2017-05-05

2017-7-25

內蒙古自治區(qū)高校蓖麻產業(yè)工程技術研究中心開放基金(MDK2016004)

徐雅楠(1984-),女,理學博士,從事生物大分子相互作用動力學研究. E-mail:yanan_0609@163.com