高松 蔣刈 戴樸

產前診斷是遺傳性疾病早發(fā)現、早診斷、早治療的重要手段，可以有效減少出生缺陷的發(fā)生風險。傳統(tǒng)的產前診斷是通過有創(chuàng)的方式，包括羊膜穿刺術、絨毛膜絨毛吸取術、胎兒臍靜脈穿刺術，獲取胎兒遺傳物質用于遺傳分析，對胎兒和孕婦有一定的風險[1]。因此，無創(chuàng)產前診斷逐漸成為研究的熱點。無創(chuàng)產前診斷中胎兒遺傳物質的來源包括孕婦外周血中游離胎兒DNA和完整的胎兒細胞。相對于胎兒游離DNA，胎兒細胞包含胎兒完整的遺傳信息，能提供更準確可靠的基因診斷。研究證實，孕婦外周血中主要存在4種胎兒來源的細胞，即滋養(yǎng)層細胞、白細胞、造血干細胞和有核紅細胞[2]。4種細胞中胎兒有核紅細胞(fetal nucleated red blood cells，FNRBC)是最理想的產前檢測的來源細胞，其優(yōu)勢包括：(1)胎兒有核紅細胞是單核細胞，分化好，形態(tài)上易辨別，含有胎兒完整的遺傳信息；(2)存活周期約90 d，在母體血循環(huán)中不會持續(xù)至下次妊娠，因此，作為產前檢測細胞來源不受上次妊娠的影響[3]；(3)細胞表面具有特異性的標志物，可作為細胞分選的依據。

胎兒有核紅細胞直徑約9～13 μm，略大于成熟紅細胞的直徑(6～8 μm)，與白細胞直徑(8～15 μm)相當；密度在1.077 g/ml至1.130 g/ml之間，與成熟紅細胞(1.090～1.110 g/ml)相似[4-5]。孕婦外周循環(huán)中胎兒細胞數量很少，據估計每1 ml孕婦外周血中約有1～3個胎兒細胞[6]。妊娠的不同階段，胎兒細胞數量也會有所不同。胎兒有核紅細胞自孕6周即可在孕婦外周血中檢出，隨著妊娠期延長，胎兒有核紅細胞數量逐漸增加，每40 ml孕婦外周血中由孕6周時的100個增加到孕末期的1 000個[7-8]。有研究認為，孕婦外周血中胎兒細胞數量與胎兒性別有關，胎兒為男性的孕婦外周血中胎兒細胞數量較多[9]。由于胎兒有核紅細胞數量稀少，必須對其進行分離富集，才能用于無創(chuàng)產前檢測。

一、孕婦外周血中胎兒有核紅細胞分離和富集主要方法

1. 密度梯度離心法(density gradient centrifugation, DGC)：該技術主要原理是根據外周血中各種細胞成份在密度、體積和沉降系數等方面的差異，利用細胞分離液通過離心的方法將目標細胞分離出來。根據所采用的介質密度的不同，可以分為單密度梯度離心、雙密度梯度離心和不連續(xù)密度梯度離心。二十世紀九十年代，有研究證明該方法在富集有核細胞、去除母源性紅細胞過程中的作用。Ganshirt-Ahlert等[10]采用不連續(xù)三重密度梯度在非整倍體妊娠的中晚期成功富集了胎兒有核紅細胞。Bhat等[11]采用Histopaque 1077、1107和1119三重密度離心的方法，與采用Histopaque 1077單密度離心方法相比，前者對血液模擬樣本中有核紅細胞的富集效率是后者的25倍。之后，密度梯度離心法成為大部分富集策略的第一步。Sekizawa等[12]評估了不同密度梯度離心法分離胎兒有核紅細胞的效率，采用熒光標記的抗γ-血紅蛋白抗體分選胎兒有核紅細胞，并進一步行FISH分析，結果顯示采用1.090 g/ml密度梯度富集的胎兒有核紅細胞數量是1.083 g/ml的3倍多。有學者采用Percoll分離液研究胎兒有核紅細胞的密度，顯示大多數胎兒有核紅細胞的密度比白細胞密度大[13]。因此，多數學者傾向采用密度更大的Ficoll 1119做為密度梯度離心法的介質[14-15]。同時有研究[12]比較了Percoll和Ficoll兩種分離液的富集效率，針對孕早期模擬樣本中回收胎兒原始紅細胞，Percoll 1118明顯優(yōu)于Percoll 1117、1119和Ficoll 1119，其平均回收率分別為64.1%、10.1%、5.5%和35.3%。密度梯度離心法操作相對簡便，耗時短，費用低，但該技術富集所得胎兒有核紅細胞數量少，純度較低，通常作為富集有核紅細胞策略的第一步，后續(xù)進一步純化目標細胞。

2. 熒光激活細胞分選法(fluorescence-activated cell sorting, FACS)：FACS是用結合有熒光染料的探針(如抗體)對細胞進行標記，再進行流式細胞分選術。1979年首次報道了采用FACS方法從孕婦外周血中成功分離出胎兒細胞[16]，之后有學者以胎兒有核紅細胞上CD71為靶點，應用FACS策略從孕婦外周血中成功獲取胎兒有核紅細胞，并在懷男胎孕婦外周血細胞中檢測到Y染色體序列[17]。 Price等[18]采用密度梯度離心和FACS(細胞大小、粒度、CD71和GPA)相結合的方法從富集的胎兒細胞中分離有核紅細胞，進一步用PCR的方法成功鑒定出全部12例男胎以及6例女胎中的5例，染色體特異的核酸探針熒光原位雜交技術(FISH)診斷出1例21-三體和1例18-三體。Bianchi等[19]采用不同的三種抗體(CD71單抗、CD36單抗、GPA單抗)FACS與密度梯度離心相結合的方法分離胎兒有核紅細胞后，再行性別鑒定；其中用CD71單抗和CD36單抗的準確率分別為57%、88%；無論單獨應用GPA單抗或與CD71單抗、CD36單抗聯合應用，結果準確率均為100%。但由于FACS設備昂貴，操作復雜，并且檢測通量低，目前并不適用于臨床。

3. 磁激活細胞分選法(magnetic-activated cell sorting, MACS)：MACS是一種免疫磁性細胞分離技術，采用結合磁性微粒的單抗與細胞表面的特異抗原結合，然后通過外加磁場，將互相結合的磁性微粒和目標細胞與其它細胞分開。G?nshirt-Ahlert等[10, 20]首次采用Histopaque-1077密度梯度離心結合CD71單抗包被的磁珠成功富集了胎兒有核紅細胞；隨后，該學者用三重密度梯度離心結合MACS(抗CD71)的方法富集胎兒有核紅細胞后，進一步用FISH的方法檢測出15例染色體異常的胎兒，其中5例18-三體，10例21-三體。Mavrou[21]等對孕中期母親外周血中胎兒有核紅細胞數量進行了研究，采集受檢者20 ml外周血，Histopaque 1 083密度梯度離心，采用MACS(抗CD71)富集，經麥格-姬姆薩(May-Griunwald-Giemsa, MGG)法染色后，顯微鏡下確認有核紅細胞并計數，發(fā)現351例樣本中306例富集到胎兒有核紅細胞，其中染色體正常胎兒孕婦外周血中平均胎兒有核紅細胞數為8個(1～12個)，而在染色體非整倍體胎兒孕婦外周血中胎兒有核紅細胞數平均為35個(7～113個)。

有學者[22]比較了FACS和MACS對胎兒有核紅細胞的富集效率，樣本采集自孕婦選擇終止妊娠后1 h內的外周靜脈血，其中FACS采用γ-珠蛋白抗體，而MACS依次采用CD45和γ-珠蛋白兩種抗體篩選策略，純化的細胞經FISH分析確認細胞來源。結果顯示，MACS方法對胎兒有核紅細胞有更高的特異性，在后續(xù)的FISH分析中細胞丟失較少；而FACS富集胎兒有核紅細胞的富集效率更高，純度也更高；同時，MACS操作時間短，花費低，而FACS需要昂貴的設備和專業(yè)人員。2002年，一項多中心臨床研究[23]比較了兩種檢測策略的優(yōu)劣，MACS對目標細胞的富集效率更高，對胎兒性別的鑒定準確性也更高。

4. 微流控技術(microfluidics)：該技術采用高靈敏度的微流控設備，利用細胞自身形狀、大小和變形性等固有特征來分離目標細胞。整個分離過程不需要抗體，并且效率較高。其用于血液組分的提取最初是為了獲得血漿或白細胞[24]。2008年，Huang等[25]采用微流控技術在58例孕婦外周血中分離出胎兒有核紅細胞，其中在37例普通妊娠中獲得經鑒定的有核紅細胞平均是37.7個/毫升(0.37～168.2個/毫升)，在21例非整倍體胎兒妊娠中獲得的有核紅細胞平均是37.2個/毫升(0.99～274.36個/毫升)，有核紅細胞產量約為MACS或SBA親和素分選法的10～20倍；作者雖然能夠去除99.99%的白細胞，但白細胞在最終富集樣本中仍有8 000～80 000個/毫升。2010年Lee等[26]采用第3代微流控技術對模擬樣本中胎兒有核紅細胞回收率為74.0%，成熟紅細胞去除46.5%。但是在實際應用的效果還未見報道。最近，有學者[27]采用兩步法分離有核紅細胞，第一步利用紅細胞的高度聚集性富集包含有有核紅細胞和白細胞的混合產物，第二步利用微流控技術分離出有核紅細胞，并采集18例孕婦外周血驗證該技術的實際效果；結果顯示，每毫升外周血樣本處理后可以得到1～396個有核紅細胞和0～6個白細胞，有核紅細胞純度為20%～100%。

5. 親和素分離法：有核紅細胞表面含有大量的半乳糖基，而大豆凝集素(soybean agglutinin，SBA)具有半乳糖特異性凝集作用，可選擇性黏附有核紅細胞，從而達到分離的目的。有學者[28]采集了131例孕6～27周的孕婦外周血，先經密度梯度離心，再采用該技術處理，在96%的孕婦外周血中分離到有核紅細胞，平均2.3 ml外周血中可得到(7.8±8.5)個有核紅細胞；FISH技術檢測8例孕有男胎的孕婦血樣，顯示超過一半的有核紅細胞為胎兒來源。2005年，Babochkina等[29]研究了SBA親和素分離法和MACS從孕婦外周血中分離有核紅細胞的效率，顯示前者分離的細胞數比后者高約8倍，并且對細胞形態(tài)影響小，易于辨認和分析；但富集細胞中混有大量母體細胞，胎兒有核紅細胞純度明顯低于MACS法。最近，有研究[30]對該技術進行了改進，孕婦外周血經密度梯度離心后，采用CD45抗體去除淋巴細胞，之后與半乳糖特異性凝集素連接固定在玻片上，染色后經自動成像分析對細胞進行分類；所有39例樣本中均可鑒別出有核紅細胞，10 ml血液中可識別出18～6 000個；在14例男胎的血樣分離標本中，FISH檢測可見10個或以上的有核紅細胞來源于胎兒。

6. 單細胞顯微操作分離法：二十世紀九十年代中期，有學者[31]采用顯微操作的方法分離有核紅細胞，并且在大部分樣本中準確鑒定出胎兒性別，開創(chuàng)了無創(chuàng)產前診斷的新途徑。之后，Sekizawa等[32]采用密度梯度離心結合顯微操作的方法獲得胎兒有核紅細胞，進一步用引物延伸預擴增(primer extension preamplification , PEP)的方法對單個有核紅細胞進行全基因組擴增，確定細胞來源于胎兒后，對可能懷有DMD胎兒的孕婦進行了產前診斷。這項技術同樣適用于其他X-連鎖遺傳病的產前診斷。有研究[33]應用類似技術，檢測了13例孕婦的胎兒RhD血型，準確率為12/13。但該技術僅局限于對男性胎兒進行診斷。之后，有學者[18]將顯微操作技術與多重PCR技術相結合，在單細胞層面研究孕婦外周血中有核紅細胞的來源，結果顯示胎兒來源的約占一半。單細胞顯微操作法不僅能獲得單個胎兒細胞，還可對明確為胎源性的細胞進行遺傳分析，因此，避免了孕婦外周血細胞的污染問題。

7. 納米材料與特異性抗體相結合：近年來，隨著材料科學的發(fā)展，納米材料與傳統(tǒng)技術相融合，在各項研究中的應用日益增多。2016年，武漢大學He等研究人員[34]以羥基磷灰石/殼聚糖納米顆粒(HA/CTS NPs)在玻璃基質上構建3D納米結構芯片，可顯著增加與修飾抗體(CD147)接觸面積，從而提升FNRBCs捕獲效率，平均每毫升孕婦外周血捕獲25個胎兒有核紅細胞；同時由于納米芯片的良好透光性，可以原位進行FISH檢測和染色體非整倍體分析；采用該技術處理10例生育男孩的孕婦外周血，分離出的FNRBCs經三色免疫熒光染色(ε-HbF，CD71，DAPI)鑒定8例為男性，而采用FISH鑒定9例為男性；對胎兒染色體非整倍體的診斷，則準確診斷出7例(4例21-三體，3例13-三體)。2017年初，有學者[35]采用類似納米技術從孕婦外周血中分離胎兒有核紅細胞，該方法首先經過Percoll 1.077 單密度梯度離心，以玻璃為載體的納米羥基磷灰石基底上修飾CD147抗體，對孕婦外周血中的胎兒有核紅細胞進行捕獲，利用HbF、CD71 以及DAPI 對有核紅細胞進行標記，實現分選目的；對10 例孕婦外周血樣本，均成功分離出胎兒有核紅細胞，然后經 FISH 鑒定，該方法對男胎診斷的靈敏度為 85.7%(6/7)，特異度為100%，對女胎診斷的靈敏度為100%，并準確診斷出 1 例21-三體胎兒。

二、胎兒有核紅細胞(FNRBC)的鑒定和應用

經過上述各種方法富集純化的有核紅細胞，并不都是胎兒來源。有研究顯示，自孕婦外周血富集純化的有核紅細胞中，大約22～50%來源于母親[21]。因此，在將純化的有核紅細胞用于產前檢測前，必須鑒定其為胎源性或母源性。目前常用的方法有：(1)特異性探針FISH分析或對Y染色體特異序列行PCR擴增，但該方法只能鑒定來源為男胎的有核紅細胞；(2)免疫標記的胚胎型珠蛋白法，包括ε-，ζ-，和γ-珠蛋白。有研究表明，ε-珠蛋白在孕早期更適合做為胎兒有核紅細胞的標志物[36, 37]。

胎兒有核紅細胞經鑒定后可以作為產前檢測的遺傳物質來源，采用相應的分子生物學技術檢測疾病。FISH能準確分析胎兒性別和染色體異常，PCR可分析單基因遺傳病。Price等[18]首次報道了利用胎兒有核紅細胞鑒定胎兒性別和診斷胎兒非整倍體，之后，FISH技術在胎兒非整倍體的檢測中廣泛展開。有學者自孕婦外周血中分離出胎兒有核紅細胞，PCR后檢測，診斷鐮狀細胞貧血和β-地中海貧血各一例[38]。Nagy等[39]分離得到胎兒有核紅細胞后利用QF-PCR檢測胎兒核型，與羊水穿刺結果比較，符合率為78.6%(11/14)。隨著單細胞全基因組擴增技術的逐漸成熟，相信會有更多的遺傳性疾病可通過孕婦外周血中的胎兒細胞得到確診。

三、小結

總之，孕婦外周血中分離富集胎兒有核紅細胞的方法眾多，這已成為產前檢測和遺傳學研究領域的熱點，并取得了部分進展。但分離富集技術與臨床推廣應用之間還有一定差距，各項技術或操作繁瑣，費時費力；或分離效率不高，細胞純度不夠；不能滿足臨床實際需求。因此，目前的研究應著重在優(yōu)化分離富集策略，尋找胎兒有核紅細胞特異性分子標志物，并提高自動化分析水平，滿足臨床大規(guī)模應用，從而真正實現無創(chuàng)產前診斷。

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