羅海恩+毛新展

[摘要] 目的 探討NF-κB p65基因沉默對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜HFLS-RA細(xì)胞增殖及凋亡的影響。 方法 采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染NF-κB p65的siRNA至HFLS-RA細(xì)胞中，利用RT-PCR和Western blot技術(shù)分別檢測(cè)HFLS-RA細(xì)胞中NF-κB p65 mRNA和蛋白的表達(dá)情況。噻唑藍(lán)MTT法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的增殖率和凋亡率。 結(jié)果 與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染siRNA后的HFLS-RA細(xì)胞中NF-κB p65 mRNA、蛋白表達(dá)量和細(xì)胞增殖率均明顯下降，而細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。 結(jié)論 NF-κB p65基因在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜HFLS-RA細(xì)胞的增殖和凋亡過(guò)程中起著重要作用，使其沉默后能夠抑制滑膜HFLS-RA細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。

[關(guān)鍵詞] 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；滑膜細(xì)胞；NF-κB；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

[中圖分類號(hào)] R593.220.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）12（b）-0008-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of NF-κB p65 gene silencing on proliferation and apoptosis of rheumatoid arthritis synovial HFLS-RA cells. Methods NF-κB p65 siRNA was transfected into HFLS-RA cells by cationic liposome LipofectamineTM2000， and the expression of NF-κB p65 mRNA and protein in HFLS-RA cells was detected by RT-PCR and Western blot respectively. The proliferation and apoptosis of HFLS-RA cells were separately detected by MTT and flow cytometry assay. Results Compared with the blank control group and the negative control group， the expression of NF-κB p65 mRNA， protein and cell proliferation rate in the HFLS-RA cells transfected with siRNA was decreased， while the apoptosis rate was increased， and the differences were statistically significant （all P < 0.05）. Conclusion NF-κB p65 gene plays an important role in the proliferation and apoptosis of synovial HFLS-RA cells in rheumatoid arthritis， and silencing its expression can inhibit the proliferation of synovial HFLS-RA cells and induce its apoptosis.

[Key words] Rheumatoid arthritis； Synovial cells； NF-κB； Cell proliferation； Cell apoptosis

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種病因未明的復(fù)雜的自身免疫疾病?；こ衫w維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LSs）過(guò)度增生是RA最顯著的特征之一，在RA的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用[1-2]。因此，尋找抑制滑膜細(xì)胞增殖或促進(jìn)凋亡的作用靶點(diǎn)，可有效緩解或治療RA病。NF-κB是一種廣泛的真核細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控著多種基因的表達(dá)，與機(jī)體的多種生理病理疾病密切相關(guān)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB在RA滑膜炎性反應(yīng)中起著重要作用[5-6]，但其具體的作用機(jī)制研究較少。本研究采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NF-κB p65的siRNA，觀察NF-κB p65基因沉默對(duì)滑膜細(xì)胞HFLS-RA增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原代滑膜HFLS-RA細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)Cell Applications公司，胎牛血清FBS和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，鼠抗NF-κB p65單克隆抗體、β-actin抗體和抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，ELx808酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Bio Tek公司，TaqDNA聚合酶、DNA marker DL2000和PCR引物購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。LipofectaminTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。TRIzol提取試劑盒和M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，Bio-Rad凝膠電泳成像儀購(gòu)于美國(guó) PE公司，CO2培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HFLS-RA細(xì)胞培養(yǎng)在含15%FBS的DMEM培養(yǎng)基（包含100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素）中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。2～3 d傳代1次，傳至第5代時(shí)取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染與分組 在轉(zhuǎn)染前1 d，以3×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于標(biāo)準(zhǔn)的6孔板中，培養(yǎng)基為高糖型DMEM培養(yǎng)液。待細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右時(shí)，按照LipofectaminTM2000說(shuō)明書(shū)的實(shí)驗(yàn)步驟，利用脂質(zhì)體將siRNA轉(zhuǎn)染至HFLS-RA細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)分為無(wú)任何處理因素的空白對(duì)照組，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA的陰性對(duì)照組和預(yù)轉(zhuǎn)染NF-κB/p65 siRNA的siRNA轉(zhuǎn)染組（siRNA轉(zhuǎn)染的終濃度為45 nmol/L）。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。endprint

1.2.3 NF-κB P65 mRNA和蛋白的表達(dá) ①采用RT-PCR檢測(cè)NF-κB p65 mRNA的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染24 h后，按照TRIzol提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組細(xì)胞的總RNA，使用ELx808酶標(biāo)儀檢測(cè)總RNA的濃度和純度，按照M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中NF-κB p65的引物參照Z(yǔ)hang等[7]實(shí)驗(yàn)：上游引物5′-GGGAAGGA？鄄ACGCTGTCAGAG-3′；下游引物5′-TAGCCTCAGGG？鄄TACTCCATCA-3′，擴(kuò)增片斷204 bp；內(nèi)參照β-actin上游引物5′-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3′，下游引物5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′，擴(kuò)增片斷132 bp。PCR擴(kuò)增條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s，56℃1 min，72℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。取PCR產(chǎn)物10 μL瓊脂糖（濃度為1.5%）凝膠電泳，以Bio-Rad凝膠電泳成像儀攝像，以β-actin為內(nèi)參，以目的基因灰度值與β-actin灰度值的比值計(jì)算目的基因片段的相對(duì)表達(dá)量。②采用Western blot檢測(cè)NF-κB p65蛋白的表達(dá)。收集轉(zhuǎn)染24 h后的各組細(xì)胞，加入裂解液提取總蛋白，使用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取上清蛋白量100 μg進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，特異性一抗（鼠抗NF-κB p65單克隆抗體和β-actin抗體）4℃孵育過(guò)夜，山羊抗小鼠IgG二抗室溫孵育2 h后，ECL顯色，經(jīng)Bio-Rad凝膠電泳成像儀采集。以β-actin為內(nèi)參，收集條帶用Image Pro Plus軟件進(jìn)行灰度定量分析。

1.2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染48 h的對(duì)數(shù)期HFLS-RA細(xì)胞，經(jīng)胰消化酶（0.25%）消化細(xì)胞后以1×104個(gè)/孔細(xì)胞濃度接種到96孔板上，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)仍以空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和siRNA轉(zhuǎn)染組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h后，棄培養(yǎng)液后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，4 h后加入200 μL DMSO，充分溶解后，使用酶標(biāo)儀在570 nm處檢測(cè)各組的吸光值OD。計(jì)算出各組細(xì)胞的增殖抑制率，增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD）×100%。

1.2.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 收集上述實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染48 h的對(duì)數(shù)期的各組HFLS-RA細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×103個(gè)/mL，經(jīng)預(yù)冷的PBS洗滌后，加入200 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL膜聯(lián)蛋白-V-異硫氰酸熒光素（Annexin-V-FITC）和10 μL碘化丙啶（PI），避光孵育10 min后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率。其中每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)5個(gè)重復(fù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)資料采用Graph Pad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中NF-κB p65 mRNA和蛋白的表達(dá)

熒光定量分析各組HFLS-RA細(xì)胞結(jié)果（圖1）顯示，NF-κB p65 mRNA空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和siRNA轉(zhuǎn)染組的mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為（0.431±0.028）、（0.410±0.042）和（0.206±0.035）。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，siRNA轉(zhuǎn)染組的NF-κB p65 mRNA表達(dá)量明顯降低（P < 0.05）。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。Western blot檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，siRNA轉(zhuǎn)染組的NF-κB p65蛋白的相對(duì)表達(dá)水平（0.336±0.042）明顯低于空白對(duì)照組（0.752±0.056）和陰性對(duì)照組（0.715±0.048），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.2 各組細(xì)胞增殖抑制率的變化

MTT法檢測(cè)各組HFLS-RA細(xì)胞結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和siRNA轉(zhuǎn)染組的增殖抑制率均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大；相同作用時(shí)間下，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，siRNA轉(zhuǎn)染組的增殖抑制率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），但空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 各組細(xì)胞凋亡水平的變化比較

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和siRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率分別為（9.12±2.16）%、（12.20±3.58）%和（20.20±4.85）%。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，siRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

3 討論

RA是一種嚴(yán)重的常見(jiàn)慢性自身免疫性疾病，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)周圍組織的非感染性炎癥，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)壞損或畸形。Vaubel首次從實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)出滑膜細(xì)胞，并將其分為巨噬樣滑膜細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞[8]。研究發(fā)現(xiàn)，成纖維樣滑膜細(xì)胞與RA滑膜病變密切相關(guān)，滑膜組織異常增生是RA的主要病理特征[9-10]。研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞增殖及凋亡的機(jī)制具有重要意義。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指利用雙鏈RNA，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)使目的基因沉默的技術(shù)，目前該技術(shù)具有高效性和高特異性性等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)疾病、腫瘤和抗病毒等研究，并成為靶向基因治療的有效工具[11-13]。

NF-κB是一種由Sen和Baltimore在小鼠B淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，在炎癥、免疫反應(yīng)中占中心地位的快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，參與了炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖及凋亡等基因的表達(dá)，并且在慢性炎性反應(yīng)過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用。NF-κB p65是NF-κB中最重要的功能性亞單位之一，可反式激活多種基因調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖及凋亡。Luo等[14]通過(guò)下調(diào)NF-κB p65發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)HeLa細(xì)胞的增殖及侵襲能力。Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)沉默NF-κB p65表達(dá)可抑制肺腺癌細(xì)胞株A549增殖并誘導(dǎo)其凋亡。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)靶向沉默p65基因可抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，TREM-2基因和CTGF基因沉默對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞遷移、侵襲和凋亡有一定的影響[16-17]。為探討NF-κB p65基因沉默是否影響滑膜細(xì)胞的增殖及凋亡，本研究將NF-κB p65小干擾RNA轉(zhuǎn)染后，檢測(cè)到滑膜HFLS-RA細(xì)胞中NF-κB p65 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均受到明顯的抑制，結(jié)果顯示所采用的siRNA成功沉默目的基因表達(dá)。本研究采用MTT法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)了轉(zhuǎn)染48 h后滑膜HFLS-RA細(xì)胞的增殖抑制率和凋亡率的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siRNA轉(zhuǎn)染組的增殖抑制率明顯降低，凋亡率明顯升高。表明NF-κB p65基因沉默可抑制滑膜HFLS-RA細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡，并提示p65基因可能是治療RA的潛在靶點(diǎn)。endprint

綜上所述，NF-κB p65基因沉默可抑制滑膜HFLS-RA細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，為研究和治療RA提供理論依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Lv YZ，Yang QW. Role of synovial fibroblasts in the pathogenesis of rheumatoid arthritis and its activation mechanism [J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，2017， 33（1）：233-240.

[2] Peng F，Xu YM，Tan H，et al. The inhibitory effects of emodin on the proliferation and metastasis of synovial cells form rheumatoid arthritis [J]. Immunological Journal，2017， 33（1）：34-39.

[3] Liu B，Sun L，Liu Q，et al. A cytoplasmic NF-κB interacting long noncoding RNA blocks IκB phosphorylation and suppresses breast cancer metastasis [J]. Cancer Cell，2015， 27（3）：370-381.

[4] Shostak K，Chariot A. EGFR and NF-κB：partners in cancer [J]. Trends Mol Med，2015，21（6）：385-393.

[5] Gao J，Liu XG，Huang DJ，et al. Involvement of the hypothalamus-pituitary-adrenal axis in moxibustion-induced changes of NF-kappaB signaling in the synovial tissue in rheumatic arthritic rats [J]. Zhen Ci Yan Jiu，2010，35（3）：198-203.

[6] Wang H，Wang Q，Shi X，et al. Expression and Significance of TLRs and NF-κB in Knee Osteoarhritic Synovial of Rats [J]. Chinese Journal of Traditional Medical Traumatology & Orthopedics，2016，24（6）：4-8.

[7] Zhang Y，Li H，Wu Y，et al. Proliferative and apoptotic effects of siRNA-mediated NF-κB/p65 gene silencing human lung adenoma A549 cells [J]. Journal of Modern Oncology，2014，22（8）：1766-1769.

[8] Jie LG，Huang RY，Sun WF，et al. Role of cysteine-rich angiogenic inducer 61 in fibroblast-like synovial cell proliferation and invasion in rheumatoid arthritis [J]. Molecular Medicine Reports，2015，11（2）：917-923.

[9] Igarashi H，Yahagi A，Saika T，et al. A pro-inflammatory role for A20 and ABIN family proteins in human fibroblastlike synoviocytes in rheumatoid arthritis [J]. Immunol Lett，2012， 141（2）：246-253.

[10] Zhang HJ，Wei QF，Wang SJ，et al. LncRNA HOTAIR alleviates rheumatoid arthritis by targeting miR-138 and inactivating NF-κB pathway [J]. Int Immunopharmacol，2017，50：283-290.

[11] Schmidt PJ，Racie T，Westerman M，et al. Combination therapy with a Tmprss6 RNAi-therapeutic and the oral iron chelator deferiprone additively diminishes secondary iron overload in a mouse model of β-thalassemia intermedia [J]. Am J Hematol，2015，90（4）：310-313.

[12] Wu S，Wen F，Li Y，et al. PIK3CA and PIK3CB silencing by RNAi reverse MDR and inhibit tumorigenic properties in human colorectal carcinoma [J]. Tumor Biology，2016， 37（7）：8799-8809.

[13] Hui W，Liu KH，F(xiàn)ang Bernard AM，et al. Identification of acetyltransferase genes（HAT1andKAT8）regulating HBV replication by RNAi screening [J]. Cell Biosci，2015，5（1）：1-9.

[14] Luo YC，Lu G，Niu HY，et al. Effect of down-regulation of nuclear factor NF-κB p65 on protein kinase R to induce cellular proliferation and invasion of cervical cancer HeLa cells [J]. Tumor，2014，34（7）：596-601.

[15] Wang L，Shan BE，Sang MX，et al. Effect of microRNA-mediated p65 gene silencing on the proliferation and apoptosis of human breast cancer MDA-MB-231 cells [J]. Journal of Southern Medical University，2011，31（10）：1742-1747.

[16] Huang SH，Li JH，Zhang WQ，et al. Effects of TREM-2 silencing on migration and invasion abilities of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes [J]. Chin J Pathophysiol，2016，32（1）：134-139.

[17] Ding S，F(xiàn)ang F，Duan HM，et al. Effect of CTGF siRNA on Apoptosis of Fibroblast-like Synoviocytes of Rheumatoid Arthritis [J]. Journal of China Medical University，2016， 45（5）：430-433.

（收稿日期：2017-09-01 本文編輯：張瑜杰）endprint