羅海恩+毛新展

[摘要] 目的 探討NF-κB p65基因沉默對類風濕性關節(jié)炎滑膜HFLS-RA細胞增殖及凋亡的影響。 方法 采用陽離子脂質體LipofectamineTM2000轉染NF-κB p65的siRNA至HFLS-RA細胞中，利用RT-PCR和Western blot技術分別檢測HFLS-RA細胞中NF-κB p65 mRNA和蛋白的表達情況。噻唑藍MTT法和流式細胞儀檢測細胞的增殖率和凋亡率。 結果 與空白對照組和陰性對照組比較，轉染siRNA后的HFLS-RA細胞中NF-κB p65 mRNA、蛋白表達量和細胞增殖率均明顯下降，而細胞凋亡率明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05）。 結論 NF-κB p65基因在類風濕性關節(jié)炎滑膜HFLS-RA細胞的增殖和凋亡過程中起著重要作用，使其沉默后能夠抑制滑膜HFLS-RA細胞增殖，誘導其凋亡。

[關鍵詞] 類風濕性關節(jié)炎；滑膜細胞；NF-κB；細胞增殖；細胞凋亡

[中圖分類號] R593.220.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）12（b）-0008-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of NF-κB p65 gene silencing on proliferation and apoptosis of rheumatoid arthritis synovial HFLS-RA cells. Methods NF-κB p65 siRNA was transfected into HFLS-RA cells by cationic liposome LipofectamineTM2000， and the expression of NF-κB p65 mRNA and protein in HFLS-RA cells was detected by RT-PCR and Western blot respectively. The proliferation and apoptosis of HFLS-RA cells were separately detected by MTT and flow cytometry assay. Results Compared with the blank control group and the negative control group， the expression of NF-κB p65 mRNA， protein and cell proliferation rate in the HFLS-RA cells transfected with siRNA was decreased， while the apoptosis rate was increased， and the differences were statistically significant （all P < 0.05）. Conclusion NF-κB p65 gene plays an important role in the proliferation and apoptosis of synovial HFLS-RA cells in rheumatoid arthritis， and silencing its expression can inhibit the proliferation of synovial HFLS-RA cells and induce its apoptosis.

[Key words] Rheumatoid arthritis； Synovial cells； NF-κB； Cell proliferation； Cell apoptosis

類風濕性關節(jié)炎（RA）是一種病因未明的復雜的自身免疫疾病?；こ衫w維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LSs）過度增生是RA最顯著的特征之一，在RA的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[1-2]。因此，尋找抑制滑膜細胞增殖或促進凋亡的作用靶點，可有效緩解或治療RA病。NF-κB是一種廣泛的真核細胞核轉錄因子，調控著多種基因的表達，與機體的多種生理病理疾病密切相關[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB在RA滑膜炎性反應中起著重要作用[5-6]，但其具體的作用機制研究較少。本研究采用陽離子脂質體轉染NF-κB p65的siRNA，觀察NF-κB p65基因沉默對滑膜細胞HFLS-RA增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原代滑膜HFLS-RA細胞購于美國Cell Applications公司，胎牛血清FBS和DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，鼠抗NF-κB p65單克隆抗體、β-actin抗體和抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗購于英國Abcam公司，ELx808酶標儀購于美國Bio Tek公司，TaqDNA聚合酶、DNA marker DL2000和PCR引物購自上海生工生物工程有限公司。LipofectaminTM2000轉染試劑購于美國Invitrogen公司。TRIzol提取試劑盒和M-MLV 逆轉錄試劑盒購于美國Gibco公司，Bio-Rad凝膠電泳成像儀購于美國 PE公司，CO2培養(yǎng)箱購于美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將HFLS-RA細胞培養(yǎng)在含15%FBS的DMEM培養(yǎng)基（包含100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素）中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。2～3 d傳代1次，傳至第5代時取對數(shù)期細胞進行實驗。

1.2.2 siRNA轉染與分組 在轉染前1 d，以3×104個/孔的細胞密度接種于標準的6孔板中，培養(yǎng)基為高糖型DMEM培養(yǎng)液。待細胞融合度達到70%左右時，按照LipofectaminTM2000說明書的實驗步驟，利用脂質體將siRNA轉染至HFLS-RA細胞中。實驗分為無任何處理因素的空白對照組，脂質體法轉染陰性對照siRNA的陰性對照組和預轉染NF-κB/p65 siRNA的siRNA轉染組（siRNA轉染的終濃度為45 nmol/L）。每組實驗重復5次。endprint

1.2.3 NF-κB P65 mRNA和蛋白的表達 ①采用RT-PCR檢測NF-κB p65 mRNA的表達水平。轉染24 h后，按照TRIzol提取試劑盒說明書提取各組細胞的總RNA，使用ELx808酶標儀檢測總RNA的濃度和純度，按照M-MLV逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，以cDNA為模板進行PCR擴增，其中NF-κB p65的引物參照Zhang等[7]實驗：上游引物5′-GGGAAGGA？鄄ACGCTGTCAGAG-3′；下游引物5′-TAGCCTCAGGG？鄄TACTCCATCA-3′，擴增片斷204 bp；內參照β-actin上游引物5′-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3′，下游引物5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′，擴增片斷132 bp。PCR擴增條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s，56℃1 min，72℃ 45 s，30個循環(huán)，72℃ 10 min。取PCR產物10 μL瓊脂糖（濃度為1.5%）凝膠電泳，以Bio-Rad凝膠電泳成像儀攝像，以β-actin為內參，以目的基因灰度值與β-actin灰度值的比值計算目的基因片段的相對表達量。②采用Western blot檢測NF-κB p65蛋白的表達。收集轉染24 h后的各組細胞，加入裂解液提取總蛋白，使用BCA法檢測蛋白濃度。取上清蛋白量100 μg進行12% SDS-PAGE凝膠電泳、轉PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，特異性一抗（鼠抗NF-κB p65單克隆抗體和β-actin抗體）4℃孵育過夜，山羊抗小鼠IgG二抗室溫孵育2 h后，ECL顯色，經Bio-Rad凝膠電泳成像儀采集。以β-actin為內參，收集條帶用Image Pro Plus軟件進行灰度定量分析。

1.2.4 細胞增殖實驗 收集轉染48 h的對數(shù)期HFLS-RA細胞，經胰消化酶（0.25%）消化細胞后以1×104個/孔細胞濃度接種到96孔板上，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，實驗仍以空白對照組、陰性對照組和siRNA轉染組，每組設5個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h后，棄培養(yǎng)液后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，4 h后加入200 μL DMSO，充分溶解后，使用酶標儀在570 nm處檢測各組的吸光值OD。計算出各組細胞的增殖抑制率，增殖抑制率=（1-實驗組OD/對照組OD）×100%。

1.2.5 細胞凋亡實驗 收集上述實驗中轉染48 h的對數(shù)期的各組HFLS-RA細胞，調整細胞濃度為5×103個/mL，經預冷的PBS洗滌后，加入200 μL結合緩沖液重懸細胞，加入5 μL膜聯(lián)蛋白-V-異硫氰酸熒光素（Annexin-V-FITC）和10 μL碘化丙啶（PI），避光孵育10 min后，上流式細胞儀檢測各組細胞的細胞凋亡率。其中每組實驗均設5個重復。

1.3 統(tǒng)計學方法

實驗中的數(shù)據(jù)資料采用Graph Pad Prism軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞中NF-κB p65 mRNA和蛋白的表達

熒光定量分析各組HFLS-RA細胞結果（圖1）顯示，NF-κB p65 mRNA空白對照組、陰性對照組和siRNA轉染組的mRNA的相對表達量分別為（0.431±0.028）、（0.410±0.042）和（0.206±0.035）。與空白對照組和陰性對照組比較，siRNA轉染組的NF-κB p65 mRNA表達量明顯降低（P < 0.05）。陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。Western blot檢測結果（圖2）顯示，siRNA轉染組的NF-κB p65蛋白的相對表達水平（0.336±0.042）明顯低于空白對照組（0.752±0.056）和陰性對照組（0.715±0.048），差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。

2.2 各組細胞增殖抑制率的變化

MTT法檢測各組HFLS-RA細胞結果顯示，空白對照組、陰性對照組和siRNA轉染組的增殖抑制率均隨時間的延長而增大；相同作用時間下，與空白對照組和陰性對照組比較，siRNA轉染組的增殖抑制率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），但空白對照組和陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.3 各組細胞凋亡水平的變化比較

流式細胞儀檢測結果（圖3）顯示，空白對照組、陰性對照組和siRNA轉染組的細胞凋亡率分別為（9.12±2.16）%、（12.20±3.58）%和（20.20±4.85）%。與空白對照組和陰性對照組比較，siRNA轉染組的細胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；陰性對照組與空白對照組細胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

3 討論

RA是一種嚴重的常見慢性自身免疫性疾病，表現(xiàn)為關節(jié)和關節(jié)周圍組織的非感染性炎癥，最終導致關節(jié)壞損或畸形。Vaubel首次從實驗室中培養(yǎng)出滑膜細胞，并將其分為巨噬樣滑膜細胞和成纖維樣滑膜細胞[8]。研究發(fā)現(xiàn)，成纖維樣滑膜細胞與RA滑膜病變密切相關，滑膜組織異常增生是RA的主要病理特征[9-10]。研究類風濕性關節(jié)炎滑膜細胞增殖及凋亡的機制具有重要意義。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指利用雙鏈RNA，通過堿基互補配對使目的基因沉默的技術，目前該技術具有高效性和高特異性性等特點，被廣泛應用于遺傳學疾病、腫瘤和抗病毒等研究，并成為靶向基因治療的有效工具[11-13]。

NF-κB是一種由Sen和Baltimore在小鼠B淋巴細胞中發(fā)現(xiàn)，在炎癥、免疫反應中占中心地位的快反應轉錄因子，參與了炎性反應、免疫應答、細胞增殖及凋亡等基因的表達，并且在慢性炎性反應過程中起著關鍵性作用。NF-κB p65是NF-κB中最重要的功能性亞單位之一，可反式激活多種基因調節(jié)細胞的增殖及凋亡。Luo等[14]通過下調NF-κB p65發(fā)現(xiàn)可促進HeLa細胞的增殖及侵襲能力。Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)沉默NF-κB p65表達可抑制肺腺癌細胞株A549增殖并誘導其凋亡。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)靶向沉默p65基因可抑制人乳腺癌細胞增殖，促進細胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，TREM-2基因和CTGF基因沉默對類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞遷移、侵襲和凋亡有一定的影響[16-17]。為探討NF-κB p65基因沉默是否影響滑膜細胞的增殖及凋亡，本研究將NF-κB p65小干擾RNA轉染后，檢測到滑膜HFLS-RA細胞中NF-κB p65 mRNA和蛋白的表達水平均受到明顯的抑制，結果顯示所采用的siRNA成功沉默目的基因表達。本研究采用MTT法和流式細胞儀檢測了轉染48 h后滑膜HFLS-RA細胞的增殖抑制率和凋亡率的變化。結果發(fā)現(xiàn)，siRNA轉染組的增殖抑制率明顯降低，凋亡率明顯升高。表明NF-κB p65基因沉默可抑制滑膜HFLS-RA細胞增殖和誘導其凋亡，并提示p65基因可能是治療RA的潛在靶點。endprint

綜上所述，NF-κB p65基因沉默可抑制滑膜HFLS-RA細胞增殖，誘導其凋亡，為研究和治療RA提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2017-09-01 本文編輯：張瑜杰）endprint