李晶，龍建武，李國娟，肖志芳，劉文

（南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院 1.內(nèi)分泌科，2.普外科，湖南 衡陽 421002）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病的慢性并發(fā)癥，其病理變化呈進(jìn)行性進(jìn)展?？刂蒲獕汉脱鞘瞧渲饕委煼绞剑荒芡耆柚乖摷膊〉陌l(fā)生、發(fā)展，引發(fā)終末期腎衰竭，導(dǎo)致患者死亡[1-2]。DN的發(fā)生與機(jī)體免疫系統(tǒng)功能紊亂及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，Toll樣受體4（toll like receptor4，TLR4）是Toll樣受體的一種，通過識(shí)別熱休克蛋白及內(nèi)毒素-脂多糖等內(nèi)源性配體激活核因子-κB（endogenous ligand activated nuclear factor，NF-κB）刺激炎癥因子轉(zhuǎn)錄、合成，激活炎癥反應(yīng)系統(tǒng)，釋放大量炎癥因子，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[3-5]。肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）與DN的發(fā)生、發(fā)展也有密切關(guān)系，近些年已逐漸成為研究熱點(diǎn)[6-8]。本研究重點(diǎn)探討TLR4及HGF在DN中的表達(dá)并進(jìn)一步分析其與疾病進(jìn)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年9月-2016年9月本院收治的DN患者72例為研究對(duì)象。根據(jù)24 h pro高低將72例DN患者分為 24 h pro高組（24 h pro＞2 000 mg，n=31）和 24 h pro低組（500 mg＜24 h pro≤ 2 000 mg，n=41）。24 h pro高組：男性18例，女性13例；年齡38～61歲，平均（52.29±5.16）歲。24 h pro低組：男性26例，女性15例；年齡40～59歲，平均（49.34±5.53）歲。另選取同期在本院健康中心體檢的健康人群20例作為對(duì)照組。男性11例，女性9例；年齡41～60歲，平均（50.29±5.19）歲。所有患者均符合中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)內(nèi)科分會(huì)制定的DN診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)者；輕度腎功能障礙者；24 h尿蛋白定量（24 h urinary protein quantitation，24 h pro）＞500 mg者；近2周血壓控制穩(wěn)定者；排除標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性腎病者；急性感染者；近2周內(nèi)發(fā)生過糖尿病酮癥酸中毒或其他嚴(yán)重急性并發(fā)癥者；腎衰竭者；近1個(gè)月內(nèi)服用對(duì)腎臟有損害藥物者；伴有腦、心或肝等重要臟器嚴(yán)重疾病者；內(nèi)分泌功能嚴(yán)重紊亂者；惡性腫瘤者；造血功能異常者。本研究通過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并經(jīng)患者及其家屬知情同意。

1.2 方法

觀察各項(xiàng)臨床與生化資料，血尿常規(guī)檢測：采集DN患者腎活檢前1天及對(duì)照組患者清晨空腹靜脈血4 ml，離心機(jī)（美國Thermo公司）1 000 r/min離心10 min分離血清，置入-20℃冰箱冷凍保存待測。另采集DN患者腎活檢前1天及對(duì)照組患者尿標(biāo)本，采用全自動(dòng)生化儀（日本Toshiba公司）檢測兩組血肌酐（serum creatinine，Scr）、24 h pro及空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），高壓液相法測糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c），采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assa，ELISA）試劑盒（上海拜力生物科技有限公司）測定3組血清中TLR4表達(dá)量及血清和尿液標(biāo)本中HGF水平。

采用免疫組織化學(xué)法（免疫組化）檢測3組患者腎組織標(biāo)本中TLR4的表達(dá)情況：做常規(guī)石蠟切片，脫蠟處理；采用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS）沖洗2～3 min，連續(xù)沖洗3次；用過氧化氫孵育10～12 min，PBS沖洗3次；采用1% Triton-100浸泡10～15 min，封閉，滴加一抗，常溫下孵育12 h，PBS沖洗3次；滴加二抗，繼續(xù)孵育20～25 min；使用二氨基聯(lián)苯胺顯色10 min左右，復(fù)染，脫水處理后封片。計(jì)算陽性細(xì)胞率[10]，對(duì)腎小管上皮細(xì)胞中TLR4表達(dá)情況進(jìn)行評(píng)分：0分為陰性表達(dá)；1分為陽性細(xì)胞率＜25.0%；2分為25.0%≤陽性細(xì)胞率≤50.0%；3分為50.0%＜陽性細(xì)胞率≤70.0%；4分為陽性細(xì)胞率＞70.0%。0分為陰性表達(dá)；1～2分為低表達(dá)；3～4分為高表達(dá)。每張切片分別隨機(jī)選15個(gè)視野（×100倍），取其平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組一般資料比較

24 h pro高組與24 h pro低組相比較，病程差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與對(duì)照組比較，DN組患者的收縮壓高于對(duì)照組（P＜0.05），舒張壓也高于對(duì)照組（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而24 h pro高組和24 h pro低組血壓（收縮壓、舒張壓）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表 1。

表1 各組基本情況比較 （±s）

表1 各組基本情況比較 （±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與24 h pro低組比較，P ＜0.05

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2.2 3組腎組織中TLR4的表達(dá)比較

24 h pro高組、24 h pro低組及正常組的TLR4的 表 達(dá) 分 別 為（6.22±1.03）、（5.79±0.89） 及（1.88±0.46）pg/ml，3組間TLR4表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=188.100，P=0.000）。DN各亞組患者腎組織中TLR4表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），24 h pro低組與24 h pro高組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組腎小管上皮細(xì)胞中TLR4陰性表達(dá)，而DN組患者腎小管上皮細(xì)胞中TLR4呈高表達(dá)，但24 h pro低組和24 h pro高組間TLR4表達(dá)無差異。見附圖。

附圖 3組腎組織中TLR4表達(dá)

2.3 3組血清與尿液中HGF、FBG、HbA1c、Scr及Ccr水平比較

3組的血清及尿液中HGF、FBG、HbA1c、Scr及Ccr水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。DN各亞組患者的FBG、HbA1c、血清及尿液中HGF水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；24 h pro高組Scr水平高于對(duì)照組和24 h pro低組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而24 h pro低組Scr水平與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；24 h pro高組Ccr水平低于對(duì)照組和24 h pro低組（P＜0.05），24 h pro低組Ccr水平與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 3組血清及尿液中HGF、FBG、HbA1c、Scr及Ccr水平比較 （±s）

表2 3組血清及尿液中HGF、FBG、HbA1c、Scr及Ccr水平比較 （±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與24 h pro低組比較，P ＜0.05

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3 討論

DN是糖尿病的3大微血管嚴(yán)重并發(fā)癥之一，隨著人口老齡化加劇，糖尿病發(fā)病率逐年增加，DN在糖尿病患者中的發(fā)病率高達(dá)30%～50%。DN患者本身存在糖代謝紊亂，而且多數(shù)患者合并心血管疾病等并發(fā)癥，治療較為復(fù)雜，預(yù)后也比一般腎病患者差[11]。DN發(fā)病機(jī)制的研究越來越多，但其發(fā)病機(jī)制仍未確切。

糖尿病屬于代謝紊亂性炎癥疾病的一種，炎癥因子在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生中起著不可忽視的作用。TLR4是一種巨噬細(xì)胞受體，其主要參與Gram陰性細(xì)菌的免疫過程，在抗感染中主要識(shí)別內(nèi)毒素一脂多糖，作為重要的因子參與免疫反應(yīng)上游的調(diào)節(jié)。已有研究證實(shí)，在大鼠模型中，高糖狀態(tài)下腎小球系膜細(xì)胞的TLR4表達(dá)升高，且隨劑量濃度升高而上升[12]，TLR4介導(dǎo)LPS胞內(nèi)信號(hào)傳遞涉及不同通路，但最終都要激活NF-κB或絲裂原活化蛋白激酶，從而啟動(dòng)細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素18（interleukin-18，IL-18）、單核細(xì)胞趨化因子（monocyte chemotactic factor，MCP-1）及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎癥因子的表達(dá)[13-14]，而該炎癥因子均參與DN的病理生理過程，且對(duì)DN的嚴(yán)重程度起決定性因素。有研究表明，DN患者腎小管的TLR4表達(dá)增加，且與糖化血紅蛋白及腎小管間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤程度成正相關(guān)，與腎小球?yàn)V過率成負(fù)相關(guān)。因此，DN患者在高糖刺激下，TLR4信號(hào)通路被激活，相關(guān)受體活化，進(jìn)而促進(jìn)IL-18、MCP-1及TNF-α等相關(guān)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄及釋放，進(jìn)一步導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化及腎小球硬化的產(chǎn)生及發(fā)展[15]。免疫組化法檢測結(jié)果顯示，對(duì)照組腎小管上皮細(xì)胞中TLR4陰性表達(dá)，而DN組患者腎小管上皮細(xì)胞中TLR4呈高表達(dá)，但24 h pro低組和24 h pro高組間TLR4表達(dá)無差異，與危正南等[16]研究結(jié)果類似，提示DN患者腎組織中TLR4的表達(dá)量高于正常人群，但與24 h pro高低無相關(guān)性，或許是通過調(diào)控相關(guān)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄及釋放引發(fā)DN，也為DN發(fā)病機(jī)制的探索提供一個(gè)新的靶點(diǎn)[17]。

HGF是由間質(zhì)細(xì)胞分泌的一種多效性因子。有研究顯示，HGF在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，腎臟病變?nèi)缒I小球腎炎等可造成HGF分泌失調(diào)。急性腎損傷時(shí)，患者腎臟及血清中HGF水平急劇升高，促進(jìn)腎上皮細(xì)胞增生，直接刺激血管新生，誘導(dǎo)腎小管形成、腎臟再生和修復(fù)[18-19]。研究顯示，外源性注射HGF可以有效減輕腎組織損傷，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞DNA合成，防止腎間質(zhì)纖維化及腎小球硬化，促進(jìn)腎功能恢復(fù)[20-21]。但HGF在血清和腎組織中過度表達(dá)可加劇腎間質(zhì)纖維化、腎小球硬化及腎小管囊性變[22-23]。有學(xué)者研究證實(shí)，在STZ制作的糖尿病腎病動(dòng)物模型中，HGF呈先上升后下降趨勢，在成模第8周其表達(dá)至高峰。此外，高糖狀態(tài)可刺激白細(xì)胞介素6及胰島素樣生長因子1等細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)C-met的表達(dá)，又可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子β等抑制HGF的表達(dá)，這類負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制在腎間質(zhì)纖維化及腎小球硬化等疾病中發(fā)揮重要作用[24-25]。研究顯示[26]，DN大鼠外源性注射HGF后，TGF-β1mRNA表達(dá)降低，24 h pro減少，DN大鼠腎臟形態(tài)及功能發(fā)生逆轉(zhuǎn)。本研究結(jié)果中，HGF在DN的發(fā)生、發(fā)展中有作用，但未看到HGF下降趨勢，是否與本研究入組患者為輕度腎功能損害者有關(guān)，還有待進(jìn)一步的研究。早期檢測HGF，可以輔助診斷DN，為DN的診斷和治療提供一種新思路。

綜上所述，DN患者腎組織中TLR4的表達(dá)與DN病情進(jìn)展密切相關(guān)，為DN發(fā)病機(jī)制的探索提供新的思路和靶點(diǎn)，早期檢測HGF，可以輔助診斷DN，但兩者在糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展過程中是否相互影響，目前還未得到證實(shí)，有待進(jìn)一步研究。

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