張揚(yáng)，李學(xué)淵，牟怡平

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院 手外科，遼寧 沈陽110024；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧 沈陽110001）

骨缺損是骨科治療面臨的主要難題之一，目前的治療方法主要包括骨移植、二次手術(shù)內(nèi)固定及人工骨填充，由于前兩者并發(fā)癥較多[1-2]，人工骨以及聯(lián)合干細(xì)胞治療越來越引起人們的重視。但由于骨缺損局部微環(huán)境處于低氧低血供的狀態(tài)，因此細(xì)胞增殖和毛細(xì)血管網(wǎng)再造都很困難。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，hif-1α）是1種關(guān)鍵的平衡氧穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)缺氧反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，其靶基因包括骨形態(tài)生成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP-2）、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子 -1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vescular endothelial growth factor，VEGF）及其受體（vescular endothelial growth factor receptor，VEGFR）等，該因子參與細(xì)胞增生、血管生成及血紅蛋白合成等病理生理過程。因此，hif-1α轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）可能通過增加組織功能骨的局部血管化、促進(jìn)細(xì)胞增殖等作用改善MSCs在缺氧局部的功能并從而促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。本研究的目的主要是探討hif-1α轉(zhuǎn)染是否會(huì)對(duì)MSCs與β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）支架的相容性產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 MSCs培養(yǎng)和鑒定

鼠齡3～4周Wistar大鼠6只，體重100～120 g，雌性，直接貼壁法分離大鼠MSCs[3]。當(dāng)MSCs 70%～80%鋪滿培養(yǎng)瓶底時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。所得細(xì)胞記為P1，同樣方法獲得P2、P3代細(xì)胞。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD45、CD90、CD14、CD73、CD105和CD34的表達(dá)。應(yīng)用成骨誘導(dǎo)分化條件培養(yǎng)液[DMEM/F12培養(yǎng)基，0.01 μmol/L地塞米松，10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉，50 μmol/L維生素C，10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）]培養(yǎng)進(jìn)行成骨細(xì)胞誘導(dǎo)，茜素紅染色鑒定[4]。

1.2 Hif-1α瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

應(yīng)用感受態(tài)細(xì)菌（大腸桿菌DH5α）擴(kuò)增pcDNA 3.0-HIF-1α-eGFP（本實(shí)驗(yàn)室保存，人HIF-1α），按質(zhì)粒小提試劑盒說明書步驟操作提取質(zhì)粒，核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定DNA濃度及純度，DNA純度為260/280 1.7～1.9，置入-20℃冰箱冷凍保存。標(biāo)本送至大連TaKaRa生物公司測(cè)序[4]。應(yīng)用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將pcDNA3.0-HIF-1α-eGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MSCs[4]。轉(zhuǎn)染條件：細(xì)胞達(dá)＞80%匯合、轉(zhuǎn)染反應(yīng)時(shí)間4 h、DNA和脂質(zhì)體比為（μg/μl）1.00∶1.25。

1.3 MSCs轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定篩選（有限稀釋法）

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后培養(yǎng)基中加入遺傳霉素（geneticin，G418）篩選，其終濃度為200 mg/L，每3～5天更換1次含有G418的篩選液。篩選7 d后胰酶消化細(xì)胞，離心，制成1 000個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液。將獲得的細(xì)胞懸液接種于96孔板，96孔板預(yù)先除第一排外每孔加0.1 ml不含抗生素的全培養(yǎng)基（11%FBS）；第1排每孔加0.1 ml細(xì)胞懸液；第2排每孔加0.1 ml細(xì)胞懸液并混勻后，從中吸出0.1 ml細(xì)胞懸液，加入到第3排中；在從第3排混勻的細(xì)胞懸液中吸取0.1 ml加入到第4排孔中；以此類推，最后1排每孔中吸出的0.1 ml懸液棄去。第2天顯微鏡下觀察標(biāo)記有單個(gè)細(xì)胞的孔，繼續(xù)培養(yǎng)，此時(shí)應(yīng)用不加G418、含有青鏈霉素的全培養(yǎng)基，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，消化傳代，移至較大培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)。應(yīng)用成骨誘導(dǎo)分化條件培養(yǎng)液（DMEM/F12培養(yǎng)基，0.01 μmol/L地塞米松，10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉，50 μmol/L維生素C，10% FBS）培養(yǎng)進(jìn)行成骨細(xì)胞誘導(dǎo)，茜素紅染色鑒定。

1.4 樣品分組

隨機(jī)選取P3代MSCs細(xì)胞（A組）和pcDNA3.0-HIF-1α-eGFP質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MSCs細(xì)胞（B組）各3瓶，與β-TCP支架共培養(yǎng)后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖情況。

1.5 細(xì)胞與β-TCP支架共培養(yǎng)

β-TCP支架材料加工成體積為20 mm×15 mm×15 mm大小，超聲清洗后烘干，高溫高壓滅菌備用。細(xì)胞消化，收集于15 ml離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.0×107個(gè)/ml，接種到制備好的β-TCP支架上，使細(xì)胞懸液均勻浸滿整個(gè)支架材料。接種完畢，轉(zhuǎn)移細(xì)胞-材料復(fù)合物到培養(yǎng)皿中，放置到37℃、5%二氧化碳C02條件下的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液。

1.6 掃描電鏡觀察

細(xì)胞接種β-TCP支架1周后對(duì)所得的樣本進(jìn)行電鏡觀察，PBS沖洗后應(yīng)用2.5%的戊二醛4℃下固定1 h，梯度酒精脫水，臨界點(diǎn)干燥。表面噴金后，掃描電鏡下觀察。

1.7 熒光染色觀察β-TCP支架上成活細(xì)胞數(shù)

采 用 4’，6-二 脒 基 -2-苯 基 吲 哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）熒光染色法。β-TCP支架用1×PBS洗3次后用4%甲醛固定20 min，PBS沖洗2次，用100 nm的DAPI（sigma）溶液染細(xì)胞核2 min。用熒光顯微鏡拍攝圖像。每個(gè)樣品隨機(jī)要確定每個(gè)樣品上的細(xì)胞附著的水平，在同樣大的不同區(qū)域取5個(gè)細(xì)胞核的圖像，然后把每個(gè)樣品的細(xì)胞數(shù)/單位面積進(jìn)行比較。

1.8 細(xì)胞增殖檢測(cè)

采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽法（3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）法。β-TCP支架在最佳培養(yǎng)條件下用3×104個(gè)/cm2密度孵育，后用PBS洗滌，再在MTT（sigma）溶液（0.5mg/ml）中孵育4 h。之后，移除MTT溶液，加入等量的二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO），低速振蕩10 min，以溶解晶體，并使溶液呈現(xiàn)紫色。200 μl所得溶液置于96孔板內(nèi)和應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定在570 nm處的吸光度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，用配對(duì)樣本W(wǎng)ilcoxon秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSCs形態(tài)學(xué)觀察

原代細(xì)胞接種24 h后已大部分貼壁，貼壁后MSCs呈棒狀或紡錘狀（見圖1）。1～2 d后，細(xì)胞可形成大小不等分散的細(xì)胞簇，細(xì)胞多伸展為長(zhǎng)梭形，胞核1、2個(gè)，圓形居中，可有1個(gè)至數(shù)個(gè)核仁。2～4 d后，細(xì)胞簇增大，呈魚群樣或漩渦狀生長(zhǎng)，與其他細(xì)胞簇逐漸融合（見圖2）。培養(yǎng)4～5 d可傳一代。

2.2 細(xì)胞表面抗原及細(xì)胞分化功能鑒定結(jié)果

流式細(xì)胞表面抗原檢測(cè)結(jié)果表明P3代的MSCs表達(dá) CD90（95.5%）、CD73（95.4%）、CD105（97.9%），基本不表達(dá) CD45（1.2%）、CD14（0.6%）、CD34（0.4%）。分離培養(yǎng)的MSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化條件培養(yǎng)液培養(yǎng)后能夠成功誘導(dǎo)成為成骨細(xì)胞（見圖3）。

圖1 MSCs接種24 h呈棒狀或紡錘狀

圖2 MSCs培養(yǎng)2～4 d后，細(xì)胞簇呈魚群樣生長(zhǎng)

圖3 MSCs成功誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞 （茜素紅染色×100）

2.3 Hif-1α轉(zhuǎn)染后MSCs分化功能鑒定及熒光表達(dá)

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hif-1α的MSCs仍能誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，證明轉(zhuǎn)染后的MSCs仍保持細(xì)胞干性（見圖4）。Hif-1α瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后12 h可見細(xì)胞有微弱熒光表達(dá)，24 h后可見綠色熒光，48 h后陽性細(xì)胞增多，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（見圖5）；72 h后熒光逐漸減弱。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后可見細(xì)胞核和細(xì)胞漿內(nèi)都有GFP表達(dá)（見圖6）。

2.4 在支架上生長(zhǎng)的MSCs形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

在培養(yǎng)1周時(shí)電鏡下觀察可見細(xì)胞貼附于材料的表面，伸展性好，一些聚集在一起，有的細(xì)胞可覆蓋材料孔隙表面，生長(zhǎng)較好，可見有突起連接并附著于孔隙內(nèi)壁，并見有膠原分泌（見圖7）。

2.5 Hif-1α轉(zhuǎn)染前后β-TCP支架MSCs成活細(xì)胞數(shù)比較

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)β-TCP支架上生長(zhǎng)的MSCs的數(shù)目也逐漸增多，在培養(yǎng)3 d時(shí)細(xì)胞數(shù)目增多明顯（見圖8），但在Hif-1α轉(zhuǎn)染前后MSCs在β-TCP支架上的生長(zhǎng)細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.725），見圖9。

圖4 MSCs瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hif-1α后成功誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞

圖5 MSCs瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hif-1α 48 h后GFP熒光蛋白表達(dá)

圖6 穩(wěn)定篩選后的轉(zhuǎn)染細(xì)胞（MSCs）胞核與胞質(zhì)均有綠色熒光蛋白表達(dá) （×100）

2.6 Hif-1α轉(zhuǎn)染前后β-TCP支架MSCs增殖比較

研究結(jié)果顯示，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖的結(jié)果。Hif-1α轉(zhuǎn)染前后MSCs在β-TCP支架上增殖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.612）。見圖10。

圖7 生長(zhǎng)于β-TCP支架表面的MSCs

圖8 兩組細(xì)胞在β-TCP支架的生長(zhǎng)情況

圖9 生長(zhǎng)在β-TCP支架上的細(xì)胞 （DAPI熒光染色）

圖10 兩組細(xì)胞增殖情況 （MTT法）

3 討論

目前，大部分研究結(jié)果提示人工骨支架、MSCs以及細(xì)胞因子聯(lián)合治療骨缺損效果最佳：BEHNIA等研究者證明應(yīng)用納米骨支架聯(lián)合MSCs和富含血小板的生長(zhǎng)因子治療兔顱骨骨缺損能夠有效促進(jìn)骨再生[5]；LUCARELLI等人應(yīng)用同種異體骨聯(lián)合基質(zhì)干細(xì)胞和富含血小板的血漿移植治療3 cm的羊骨骼缺損，在術(shù)后4個(gè)月的隨訪時(shí)骨組織計(jì)量學(xué)分析顯示有42.8%～54.1%的新骨形成[6]；LI等人研究得出結(jié)論，應(yīng)用β-TCP聯(lián)合BMP-2基因修飾的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療犬尺骨骨缺損，隨訪16周時(shí)骨組織計(jì)量學(xué)分析表明聯(lián)合治療組新骨形成增加，骨缺損新骨面積/總表面積為（39.95±8.55）%[7]；HE等人使用聚乳酸-羥基乙酸共聚物/磷酸鈣骨水泥聯(lián)合BMMSCs和富含血小板的血漿治療兔6 mm×10 mm股骨骨缺損，術(shù)后12周顯示聯(lián)合治療組新骨形成較好[8]；PROSECKáE等研究者證明在應(yīng)用ε聚己內(nèi)酯/羥磷灰石聯(lián)合MSCs和富含血小板溶液可獲得最多且分布最均勻的新生骨[9]；KIM等發(fā)現(xiàn)，在臨床上ε聚己內(nèi)酯-磷酸三鈣聯(lián)合自體纖維蛋白膠以及MSCs和重組人BMP-2的復(fù)合材料是促進(jìn)新骨形成的最佳組合[10]。在相關(guān)研究中，LIU等人的研究表明，納米羥基磷灰石/聚L-乳酸聯(lián)合牙髓干細(xì)胞和重組人BMP-2共同治療8 mm大小的兔牙槽骨的骨缺損所得骨礦物質(zhì)沉積為（1.77±0.11）%，其小于應(yīng)用不含重組人BMP-2的對(duì)照組，后者的骨礦物質(zhì)沉積為（2.52±0.33）%[11]。聯(lián)合治療更有效的原因可能是細(xì)胞因子的應(yīng)用增加細(xì)胞的生物活性和局部血管化。Hif-1α的靶基因編碼的蛋白，如VEGF、BMP-2等均在此方面具有優(yōu)勢(shì)，因此可以考慮將Hif-1α引入復(fù)合組織人工骨中。

Hif-1α轉(zhuǎn)染與其他細(xì)胞因子復(fù)合相比較的優(yōu)勢(shì)在于其可表達(dá)多種細(xì)胞因子，且具有穩(wěn)定表達(dá)Hif-1α的干細(xì)胞可以持續(xù)且穩(wěn)定的分泌細(xì)胞因子，不會(huì)因術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)而作用快速消失。而且Hif-1α能夠改善低氧環(huán)境下細(xì)胞的生物活性，對(duì)骨缺損的低氧低灌注微環(huán)境下干細(xì)胞的存活提供有利條件。本研究結(jié)果證明Hif-1α轉(zhuǎn)染前后MSCs的細(xì)胞干性和生物活性均無變化，后者與支架之間的相容性亦未受到影響，而且通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法可以避免應(yīng)用病毒轉(zhuǎn)染的繼發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，因此應(yīng)用本研究的方法合成組織人工骨是可行的。

本研究的局限性在于只證實(shí)Hif-1α轉(zhuǎn)染的MSCs用于聯(lián)合支架治療骨缺損的可行性，其有效性還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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